Далее рассчитывают среднюю концентрацию пэг в препарате (Сср) в мкг/мл по формуле:

, где

N – количество проб, для которых была определена С2.

Содержание полиэтиленгликоля в препарате должно быть не более 5000 мкг/мл.

2. Определение содержания остаточного этанола

Определение остаточного содержания этилового спирта в препарате проводят методом газожидкостной хроматографии.

1. Сущность метода. Метод основан на различной скорости перемещения веществ, находящихся в газообразном состоянии, относительно неподвижной фазы

2. Аппаратура, материалы, реактивы.

Для анализа применяют хроматограф газовый лабораторный типа «Кристалл-2000» или «Купол-55» с пламенно-ионизационным детектором с пределом обнаружения 5х10^-12 гС/с. Анализ проводят на кварцевой капиллярной колонке длиной 25 м с внутренним диаметром 0,32 мм, содержащей в качестве неподвижной жидкой фазы ПЭГ-20М. Допускается проведение анализа на насадочной колонке из стекла или нержавеющей стали длиной 2 м, внутренним диаметром 3 мм, содержащей 15% ПЭГ-20М на хромосорбе N-AW-DMCS или хроматоне N-AW-DMCS фракции 0,16-0,2 или 0,2-0,25 мм.

н-бутиловый спирт, ТУ 6-09-4344-77.

н-пропиловый спирт, ГОСТ 5208-81.

Ацетон, ГОСТ 2768-84.

Центрифуга лабораторная типа ОПн-8УХЛ4.2, ТУ 5.375-4261-76.

Пенициллиновый флакон, ТУ 64-2-10-86.

Микрошприц МШ-10.

3. Условия проведения анализа. Температура испарителя - 180C. Температура детектора - 180C. Температура колонки - 70C. Газ-носитель – азот. Коэффициент сброса пробы – 1:40 (при использовании капиллярной колонки). Скорость газа-носителя - 40 мл/мин. Объем вводимой пробы - 1 мкл.

4. Приготовление сорбента. Носитель заливается ацетоном таким образом, чтобы он весь был покрыт слоем ацетона. Неподвижную фазу в количестве 15 % от массы носителя растворяют в избытке ацетона и при осторожном перемешивании добавляют к носителю. Растворитель удаляют на водяной бане. Полученную насадку сушат в сушильном шкафу при температуре от 80 до 100 С до отсутствия запаха растворителя.

5. Подготовка хроматографической колонки.

Заполнение хроматографической колонки насадкой, а также монтаж, наладку и вывод хроматографа на режим производят в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору.

Перед проведением анализа заполненную колонку необходимо кондиционировать при температуре 190С и расходе газа-носителя 30 мл/мин в течение не менее 8 часов до появления постоянной нулевой линии.

6. Приготовление раствора внутреннего стандарта. В мерную колбу объемом 500 мл помещают 1 мл н-пропилового спирта, доводят до метки н-бутиловым спиртом и тщательно перемешивают

7. Методика проведения анализа.

Пробу препарата объемом 0,2 мл приливают к 5 мл раствора внутреннего стандарта. Экстракцию этилового спирта проводят в стеклянных пробирках объемом 10 мл с резиновыми пробками в течение 10 минут, периодически помешивая содержимое. Отделяют раствор от осадка центрифугированием в течение 10 мин при 5000 оборотах в минуту в герметично закрытой центрифужной пробирке или выстаиванием в течение ночи. 1 мкл надосадка вводят в хроматограф. Анализ производят не менее 3 раз.

Порядок выхода компонентов: этиловый спирт, н-пропиловый спирт, н-бутиловый спирт.

Степень разделения пиков компонентов должна быть не менее 90%.

Площади пиков компонентов определяют с помощью программного обеспечения хроматографа.

Калибровка хроматографа проводится по методу внутреннего стандарта с использованием калибровочных растворов с известным содержанием спирта.

Для приготовления серии калибровочных растворов к 5 мл раствора внутреннего стандарта, помещенного в пенициллиновый флакон, с помощью микрошприца МШ-10 добавляют соответственно 10; 8; 6; 4; 2 мкл этилового спирта и тщательно перемешивают встряхиванием.

Каждый полученный калибровочный раствор хроматографируют не менее 5 раз, определяя относительную площадь этилового спирта по формуле:

где S_отн – относительная площадь пика этилового спирта;

S_сп – площадь пика этилового спирта на хроматограмме;

S_ст – площадь пика внутреннего стандарта

Полученные результаты усредняют. По полученным результатам строят график зависимости S_отн от содержания этилового спирта в калибровочном растворе (V).

8. Обработка результатов анализа.

Из полученных хроматограмм пробы препарата рассчитывают значения S отн, усредняют и далее, с использованием полученного калибровочного графика, определяют содержание этилового спирта (мкл) в анализируемом растворе.

Содержание этилового спирта в препарате рассчитывают по формуле:

X=0,5V, где

X – содержание спирта в препарате, %;

 - плотность этилового спирта, г/мл;

V – содержание спирта (мкл) в растворе.

За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 10 % .

Содержание этилового спирта в препарате должно быть не более 2 %.

8. Определение специфической безопасности препарата

С целью определения в составе препарата антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота проводят анализ методом двойной радиальной иммунодиффузии, используя коммерческие тест-системы в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями по применению. Препарат не должен содержать антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.

8. Определение стерильности.

Стерильность определяют согласно ГФ XI, вып.2, с.187 или «Инструкции по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов» – И 42-2-89, утвержденной 29.05.95г. Минздравом России. Препарат должен быть стерильным.

8. Определение безвредности.

Определение безвредности проводят по методике, изложенной в Сборнике инструкций, утвержденном приказом Минздрава СССР от 13.03.83 г. N 31. Тест-доза 2,5%-ного раствора белка препарата в объеме 0,5 мл и 5 мл на белую мышь или морскую свинку, соответствен­но. Срок наблюдения 10 сут. В течение этого срока все животные должны быть живы и клинически здоровы. Препарат должен быть безвредным.