Далее рассчитывают среднюю концентрацию белка в препарате (Сср) в % по формуле:

Содержание белка в препарате должно быть от 5 до 7 %.

2. Определение посторонних примесей

1. Содержание остаточного полиэтиленгликоля (ПЭГ) в препарате.

1. Сущность метода. Метод основан на поглощении света с длиной волны 460 нм комплексами оксиэтильных групп ПЭГ с индикаторным реагентом – йодом.

2. Аппаратура, материалы, реактивы.

Спектрофотометр типа СФ-16, СФ-24 или СФ-46 произ­водства "ЛОМО" г. Санкт-Петербург, или фотоэлектроколориметр типа КФК 2М, КФК 3М, Оптико-механический завод (г. Загорск).

Центрифуга типа ОПн-8УХЛ4.2 ТУ 5.375-4261-76.

Вода дистиллированная, Н₂О, ГОСТ 6709-72.

Натрий уксуснокислый, 3-х водный, NaCH₃COO2H₂O, ГОСТ 199-78.

Кислота уксусная, CH₃COOH, ГОСТ 61-75.

Йод, стандарт-титр по ТУ 6-09-2540-87.

ПЭГ 115, ТУ 6-14-826-86.

Пробирки мерные по ГОСТ 1770-74.

Этиловый спирт ректификованный ГОСТ 18300-87.

3. Приготовление рабочих растворов.

   1. Приготовление ацетатного буфера рН 4,8. В химический стакан вместимостьюе 100 мл помещают 1,6 г ацетата натрия, приливают 50 мл дистиллированной воды. В тот же стакан добавляют 0,451 мл концентрированной уксусной кислоты. Перемешивают на магнитной мешалке в течение 15 минут. Затем раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

   2. Приготовление йодного реактива. К 88 мл ацетатного буфера добавить 3 мл 0,1 М раствора йода. Раствор хранится в плотно закрытой посуде темного стекла.

4. Построение калибровочного графика. 100 мг ПЭГ помещают в мерную колбу вместимостью 1 л. Заливают дистиллированной водой до метки. Растворяют при перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 минут. Полученный раствор ПЭГ дозировано приливают в конические пробирки на 10 мл (ГОСТ 1770-74) по 1000, 800, 500, 200, 100, 50 мкл, дистиллированной водой доводят объем раствора в каждой пробирке до 1000 мкл. Затем добавляют в каждую пробирку по 6 мл йодного реактива перемешивают и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Далее измеряют оптическую плотность при 460 нм. Строят график, по оси абсцисс которого откладывают концентрацию ПЭГ в масштабе 10 мкг = 20 мм, по оси ординат – значение полученной оптической плотности в масштабе 0,2 = 20 мм. Через полученные на графике точки проводят прямую.

5. Методика определения.

Для определения 1 мл препарата помещают в пробирку вместимостью 20 мл со шлифом типа КШ 14/23, приливают туда же 1 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешивают. К полученному раствору приливают 10 мл 96 % ректификованного этилового спирта и тщательно перемешивают встряхиванием, закрывают пробкой и оставляют при комнатной температуре на 24 часа. Затем полученную суспензию центрифугируют на центрифуге типа ОПн-8УХЛ4.2 при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее необходимо приготовить разведения надосадка. Для этого в ряд конических пробирок на 10 мл вносят последовательно 100, 50, 33, 25, 20 мкл надосадка и доводят объем в каждой пробирке до 1 мл, добавляя соответственно 900, 950, 967, 975 и 980 мкл дистиллированной воды. Таким образом, получают ряд разведений кратностью 10, 20, 30,40 и 50 раз.

В каждую пробирку приливают 6 мл йодного реактива. Перемешивают встряхиванием. Выдерживают 20 минут при комнатной температуре, а затем определяют оптическую плотность при длине волны 460 нм и толщине кюветы 10 мм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре. Используя калибровочный график, определяют концентрацию ПЭГ в каждой пробирке (С1). Рассчитывают концентрацию ПЭГ в надосадке (С2). Для этого берут только значения концентраций, входящие в интервал от 5 до 100 мкг/мл. Все значения, не входящие в этот интервал, не используются для дальнейших расчетов. Концентрацию полиэтиленгликоля (в мкг/мл) рассчитывают по формуле:

, где

n – кратность разведения.