2. Требования безопасности.

2.1. Требования техники безопасности и производственной санитарии вы­полняют в соответствии с «Правилами безопасности, производственной санитарии, охранно-карантинного и ветеринарно-сани­тарного режимов на предприятиях биологической промышленности», утвержденными Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ от 07.06.99 г. и ГОСТ 12.1.008-76.

2.2. Утилизация препарата, не прошедшего контроль, а также с истекшим сроком годности не требует специальных мер безопасности.

3. Правила приемки

3.1. Приемка каждой серии препарата осуществляется в соответствии с ОСТ 10-07-001-93.

3.2. Для контроля качества препарата от каждой серии отбирают выборку согласно ОСТ 10-07-001-93. Из выборки отбирают среднюю пробу в количестве 6 флаконов. Половину используют для проведения контроля по показателям качества, заложенным в ТУ, а остальные хранят в архиве в течение срока годности препарата. Правила хранения и маркировка архивных образцов согласно ОСТ 10-07-001-93.

3.3. Контроль препарата поступившего с рекламацией проводит профильная лаборатория ВГНКИ в Институте или на предприятии–изготовителе.

4. Методы испытаний.

1. Определение внешнего вида, цвета, запаха, наличия механических примесей, плесени, трещин флаконов. Каждый флакон с препаратом исс­ледуют визуально и одновременно проверяют на правильность этикетирова­ния.

1. Прозрачность препарата определяется с помощью инструменталь­ного анализа.

   1. Сущность метода. Метод основан на определении кажущегося поглощения света с длиной волны 540 нм, обусловленного его рассеивани­ем.

   2. Аппаратура, материалы и реактивы.

Спектрофотометр типа СФ-46, СФ-16 или СФ-24, производства "ЛОМО" г. Санкт-Петербург, или фотоэлектроколориметр типа КФК-2М, КФК 3М, Оптико-механический завод (г. Загорск)

Хлорид натрия, NaCl, ГОСТ 4233-77.

Вода дистиллированная, Н₂О, ГОСТ 6709-72.

3. Методика определения.

Препарат объемом (3,5+0,2) мл заливают в спектрофотометрическую кювету для слоя жидкости толщиной 10 мм и фотометрируют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре в зеленой области видимого света при длине волны 540 нм. В ка­честве контрольной пробы используют (3,5+0,2)мл 0,15 моль/л раствора натрия хлорида, помещенного в кювету с аналогичными рабочими характе­ристиками. 0,15 моль/л раствора хлорида натрия готовят в соответствии с п. 4.7.1.3. Показатель мутности препарата не должен превышать 0,1 еди­ницы оптической плотности.

2. Цветность препарата определяется с помощью инструменталь­ного анализа.

1. Сущность метода. Метод основан на поглощении света гемсодержащими белковыми структурами при длине волны 400 нм.

2. Аппаратура, материалы и реактивы.

Спектрофотометр типа СФ-46, СФ-16 или СФ-24, производства "ЛОМО" г. Санкт-Петербург, или фотоэлектроколориметр типа КФК-2М, КФК 3М, Оптико-механический завод (г. Загорск).

Хлорид натрия, NaCl, ГОСТ 4233-77.

Вода дистиллированная, Н₂О, ГОСТ 6709-72.

3. Методика определения.

Препарат объемом (3,5+0,2)мл заливают в спектрофотометрическую кювету для слоя жидкости толщиной 10 мм и фотометрируют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре в сине-зеленой области при длине волны 400 нм. В качестве контрольной пробы используют (3,5+0,2) мл 0,15 моль/л раствора натрия хлорида, помещенного в кювету с аналогичными рабочими характеристика­ми. 0,15 моль/л раствора хлорида натрия готовят в соответствии с п. 4.7.1.3.

Показатель цветности препарата не должен превышать 0,5 единицы оптической плотности.

2. Определение механических включений проводят в соответствии с «Инструкцией по контролю инъекционных растворов на механические включения» И-42-3-85. Механические включения должны отсутствовать.

2. Определение подлинности препарата.

1. Подлинность препарата определяют методом двойной радиальной иммунодиффузии, используя поликлональные антисыворотки, полученные в соответствии с п. 4.2.4. Допускается применение коммерческих антисывороток с аналогичными показателями качества.

2. Сущность метода. Метод основан на образовании преципитата при взаимодействии антигена со специфической антисывороткой.

3. Аппаратура, материалы, реактивы.

Весы лабораторные аналитические типа ВЛР-200, или аналогичные, соответствующие 2 классу точности по ГОСТ 24104-88.

Магнитная мешалка типа ММ 5, ТУ 25-11.834-80.

Дистиллятор ДЭ-25, производительность 25 л/ч, мощность 18 кВт

рН-метр типа ЭВ-74 или рН-121 с набором стеклянных электродов, з-д измерительных приборов, г. Гомель.

Термостат ГС 80М-2, Одесское ПО «Медлабортехника».

Вода дистиллированная, H₂O, ГОСТ 6709-72.

Полный адъювант Фрейнда.

Неполный адъювант Фрейнда.

Кролики породы советская шиншилла массой 2,5-3 кг.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, Na₂HPO₄2H₂O, ГОСТ 4172-76.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, КH₂PO₄, ГОСТ 4198-75.

Препарат «Альбумин С», ООО «Ижбиовет».

Препарат «Альбумин Н», ООО «Ижбиовет».

Натрий хлористый, NaCl, ГОСТ 4233-77.

Агароза, импортная.

Азид натрия, импортный.

4. Получение активных антисывороток. Для получения вышеперечисленных антисывороток в качестве иммуногена используют сыворотку крови крупного рогатого скота, сыворотку крови барана или сыворотку крови свиньи. Для получения одной антисыворотки используют двух взрослых здоровых кроликов, самцов, породы советская шиншилла. Каждому кролику в область лимфатических узлов вводят по 500 мкг иммуногена, смешанного с адъювантом Фрейнда. Через 30 суток кролику делают повторные инъекции: 250 мкг антигена – внутривенно, 250 мкг белка - подкожно в область подколенного лимфатического узла. После перерыва в течении 1 месяца вновь проводят внутривенную инъекцию в дозе 500 мкг. Отбор крови осуществляют на 5-7 сутки после окончания иммунизации. Полученная из крови антисыворотка при анализе в иммуноэлектрофорезе с исходным иммуногеном должна регистрировать не менее 15 линий преципитации (см. раздел 4.4. «Определение фракционного состава»). Нативную антисыворотку хранят в замороженном состоянии при температуре –20 ⁰С, предварительно разлив ее во флаконы по 0,5-1 мл.

5. Приготовление рабочих растворов.

   1. Приготовление 0,15 моль/л фосфатного буферного раствора, рН 7,2. В стакане объемом 100 мл растворяют 0,907 г KH₂PO₄– раствор А. В стакане объемом 100 мл растворяют 1,187 г Na₂HPO₄ x 2H₂O – раствор Б. К 59,2 мл раствора А под контролем рН метра прибавляют приблизительно до 200 мл раствор Б, до рН 7,2.

   2. Приготовление забуференного физиологического раствора. К 180 мл 0,15 моль/л раствора натрия хлорида добавляют 20 мл 0,15 моль/л фосфатного буферного раствора (рН 7.2), перемешивают и растворяют при перемешивании 40 мг азида натрия.

   3. Приготовление 1,5 %-го агарозного геля. 3 г агарозы расплавляют на водяной бане при температуре 90+5 ⁰С в 200 мл забуференного физиологического раствора и варят 30-40 минут. Расплавленную агарозу мерно разливают в пробирки по 6 мл. Пробирки герметично закрывают и помещают в холодильник (6+2) ⁰С, срок хранения 8-12 месяцев

   4. Приготовление 0,5%-го агарозного геля. 0,5 г агарозы растворяют в 100 мл дистиллированной воды и варят на водяной бане при 90 ⁰С в течение 20-30 минут. Расплавленную агарозу мерно разливают в пробирки по 12 мл или 6 мл. Пробирки герметично закрывают и помещают в холодильник (6+2) ⁰С, срок хранения 8-12 месяцев.

6. Обработка предметных стекол. Предметные стекла моют хромовой смесью, ополаскивают водопроводной и затем дистиллированной водой, выдерживают в сушильном шкафу при температуре 160-200 ⁰С. Остывшее стекло покрывают тонкой пленкой 0,5%-го агарозного геля: приблизительно 1 мл расплавленной агарозы размазывают стеклянной палочкой по поверхности стекла; можно также использовать технику "гематологического мазка" - проводят другой стеклянной пластинкой, наклоненной под углом 45 ⁰. Пластины помещают на 15-20 минут в термостат при температуре 60 ⁰С. Обработанные таким образом пластины помечают с обратной стороны, поскольку высушенная агарозная пленка невидима. Обработанные пластины прокладывают фильтровальной бумагой и хранят при комнатной температуре в течение 1-2 месяцев.

7. Методика определения.

   1. Обработанные 0,5%-ым агарозным гелем предметные стекла помещают на горизонтальный столик (агарозной пленкой вверх). В кипящей водяной бане расплавляют порцию 1,5%-го агарозного геля: на 1 предметное стекло – 5-6 мл. Расплавленный гель выливают в центр предметного стекла, одновременно перемещая флакон по длине стекла, при этом край про­бирки следует максимально приблизить к поверхности стекла. В застывшем геле пробива­ют одну центральную и шесть периферических лунок диаметром 3,5 мм. Расстояние от центра центральной лунки до центра периферических лунок, а также расстояние между центрами двух близлежащих периферических лунок должно составлять 9 мм. Гелевые пробки удаляют с помощью иглы.

   2. При анализе препарата «Альбуминат», выделенного из сыворотки или плазмы крови крупного рогатого скота, используют кроличью антисыворотку, специфичную к белкам сыворотки крови крупного рогатого скота. При анализе препарата «Альбуминат», выделенного из сыворотки или плазмы крови мелкого рогатого скота, используют кроличью антисыворотку, специфичную к белкам сыворотки крови барана. При анализе препарата «Альбуминат», выделенного из сыворотки или плазмы крови свиньи, используют кроличью антисыворотку, специфичную к белкам сыворотки крови свиньи.

   3. В центральную лунку при помощи автоматического микродозатора заливают 20 мкл препарата, предварительно разведенного с помощью 0,15 моль/л раствора хлорида натрия до концентрации белка 0,5 мг/мл. В периферические лунки заливают по 20 мкл кроличьей антисыворотки: не разведенную и разведенную в 2, 4, 8, 16, 32 раза. Разведения антисыворотки делают, используя в качестве растворителя 0,15 моль/л раствора хлорида натрия. Пластины помещают во влажную камеру при температуре +4 - +20 ⁰С на 24 часа. Препарат считается подлинным, если в специфической (видовой) системе тестирования обнаруживается линия преципитации при максимальном разведении антисыворотки. Сравнение проводится с видовыми препаратами «Альбумин С» (ООО «Ижбиовет») и «Альбумин Н» (ООО «Ижбиовет») разбавленными до концентрации белка 0,5 мг/мл 0,15 моль/л раствором хлорида натрия. В неспецифической системе тестирования могут формироваться преципитаты в титре не более чем 1/4.

2. Определение электрофоретической однородности.

1. С целью определения электрофоретической однородности препарата проводят электрофорез в градиентном полиакриламидном геле в диссоциирующих условиях. Электрофоретическая однородность выражается в процентах по отношению к общему количеству белка в препарате.

2. Сущность метода. Анализ основан на разделении белков под действием электрического поля в зависимости от их молекулярной массы. При этом основной компонент препарата представляет собой одну мажорную полосу с молекулярной массой 65-68 кДа.

3. Аппаратура, материалы, реактивы.

Весы лабораторные аналитические типа ВЛР-200, или аналогичные, соответствующие 2 классу точности по ГОСТ 24104-88.

Электрофоретическая камера вертикальной компоновки из стекла размером 12x15 см. Камера должна быть снабжена системой охлаждения. Рекомендуется использовать электрофоретические камеры серии «Hoefer» производства фирмы «Amersham Pharmacia Biotech».

Источник питания типа ПЭФ-3 ТУ 5-375-4231-77 или аналогичный, позволяющий получать постоянное напряжение до 400 В при силе тока до 100 мА.

рН-метр типа ЭВ-74 или рН-121 с набором стеклянных электродов, з-д измерительных приборов, г. Гомель.

Магнитная мешалка типа ММ 5, ТУ 25-11.834-80.

Насос перистальтический типа Varioperpex 12000, "LKB", Швеция.

Денситометр типа ОЕ 503, «LMM», Венгрия.

Самописец типа ОН-814/1 «Radelkis», Венгрия.

Акриламид, C₃H₅NO, "Serva", Германия.

Метиленбисакриламид, C₇H₁₀N₂O₂, "Serva", Германия.

Натрия додецилсульфат, C₁₂Н₂₅O₄NaS, ТУ 6-09-64-75 .

Аммония персульфат, (NH₄)₂S₂O₈, "Serva", Германия.

Тетраэтилметилендиамин (ТЕМЕД), C₆H₁₆N₂, "Serva", Германия.

Трис-(оксиметил)-аминометан (Трис), C₄H₁₁O₃N, ТУ 6-09-4292-76.

Кислота трихлоруксусная, CCl₃COOH, ТУ 6-09-1926-77.

Бромфеноловый синий, C₁₉H₉Br₄O₅SNa, "Serva", Германия.

Кумасси R-250, "Pharmacia", Швеция.

2-Меркаптоэтанол, C₂H₆OS, "Serva", Германия.

Кислота уксусная, CH₃COOH, ГОСТ 61-75.

Этанол, C₂H₅ОH, ГОСТ 18300-87.

Вода дистиллированная, H₂O, ГОСТ 6709-72.

4. Приготовление рабочих растворов.

   1. Приготовление концентрированного раствора акриламида для 3% геля (раствор B). В стакане объемом 50 мл растворяют 0,78 г ме­тиленбисакриламида в 20 мл дистиллированной воды, затем растворяют 12 г акриламида, раствор переливают в мерный цилиндр объемом 50 мл и об­щий объем раствора доводят до 40 мл дистиллированной водой.

   2. Приготовление концентрированного раствора акриламида для 25% геля (раствор C). В стакане объемом 50 мл растворяют 60 мг ме­тиленбисакриламида в 20 мл дистиллированной воды, затем добавляют 25 г акриламида, раствор переливают в мерный цилиндр объемом 50 мл и общий объем раствора доводят до 50 мл дистиллированной водой.

   3. Приготовление трис-HCl буферного раствора, pH 8,9 (раствор A). В стакане объемом 50 мл растворяют 5,65 г трис в 20 мл дистиллированной воды, концентрированной HCl доводят pH до 8,9, добавляют 60 мкл ТЕМЕД, переливают раствор в мерный цилиндр на 25 мл и доводят объем раствора до 25 мл дистиллированной водой.

   4. Приготовление трис-HCl буферного раствора, pH 6,8 (раствор K). В стакане объемом 50 мл растворяют 0,75 г триса в 10 мл H₂0 и pH доводят 2М HCl до 6,8, затем добавляют 60 мкл ТЕМЕД, перели­вают раствор в мерный цилиндр объемом 25 мл и доводят общий объем раствора до 25 мл дистиллированной водой.

   5. Приготовление раствора персульфата аммония. 25 мг пер­сульфата растворяют в 5 мл дистиллированной воды.

   6. Приготовление 40% раствора сахарозы. 8 г сахарозы растворяют в 10 мл дистиллированной воды, переливают в мерный цилиндр объемом 25 мл и доводят объем раствора до 20 мл дистиллированной водой.

   7. Приготовление электродного буфера. В колбе объемом 500 мл растворяют 7,2 г глицина в 450 мл дистиллированной воды, pH раствора доводят до 8,3 добавлением сухого трис при перемешивании, объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. В раствор добавляют 0,5 г сухого додецилсульфата натрия.

   8. Приготовление 10% раствора додецилсульфата натрия. 2 г додецилсульфата натрия растворяют в 15 мл дистиллированной воды. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 20 мл в мерном цилиндре объемом 25 мл.

   9. Приготовление буфера для образ­цов. К 2 мл раствора K добавляют 2 мл 10% раствора додецилсульфата натрия.

   10. Приготовление фиксирующего раствора. Фиксирующий раствор готовят растворением 200 г трихлоруксусной кислоты в 800 мл дистиллированной воды.

   11. Приготовление раствора для окрашивания белка. Навеску 200 мг Кумасси R-250 растворяют в смеси 125 мл этанола и 50 мл уксус­ной кислоты. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят объем дистиллированной водой до метки.

   12. Приготовление раствора для отмывки геля. В мерном стакане вместимостью 1000 мл смешивают 70 мл уксусной кислоты и 930 мл дистиллированной воды.

5. Приготовление пластин с градиентным полиакриламидным ге­лем. Градиент концентрации акриламида получают с использованием гради­ентного формера, устроенного по принципу сообщающихся цилиндрических сосудов одинакового поперечного сечения, который позволяет получать линейный градиент. Объем каждого сосуда 10 мл. Состав смешиваемых на градиентном формере растворов следующий:

Раствор для 3% геля акриламида: 1,6 мл раствора A; 0,8 мл раство­ра B; 1 мл раствора сахарозы; 4,1 мл дистиллированной воды; 80 мкл 10% раствора додецилсульфата.

Раствор для 25% геля акриламида: 1,6 мл раствора А; 4 мл раствора С; 1 мл раствора сахарозы; 1,3 мл дистиллированной воды; 80 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия.

Растворы сливают раздельно в пенициллиновые флаконы и в них дегазируют 10 мин. Воздух из-под резиновой пробки отсасывают шприцем на 10 мл при помощи иглы диаметром 0,6 мм. После дегазирования добав­ляют к 3% раствору акриламида 0,5 мл раствора персульфата аммония, а к 25% раствору акриламида - 0,1 мл персульфата аммония.

Полученные растворы тщательно перемешивают избегая вспенивания и заливают в градиент­ный формер в каждый из отсеков по 6-6,5 мл растворов подлежащих смеши­ванию, после чего перемычку между сосудами открывают. В сосуде ближай­шем к выходному отверстию должен быть залит раствор с концентрацией 25% акриламида. В нем же находится магнитная вертушка. Перемешивание осуществляется магнитной мешалкой типа ММ 5.

В кювету 120Х150Х1 мм раствор заливают при помощи перистальтического насоса LKB Varioperpex 1200 через тонкую трубку диаметром 0,8 мм. Скорость подачи раствора 1,6 мл/мин. Трубку по мере заполнения пластины поднимают вместе с уровнем раствора. По окончании наслаивают дистиллированную воду. Полимеризация начинается через 40-50 минут после окончания заливки. Для полного завершения полимеризации гель лучше оставить на ночь. После полной полимеризации наслоенную воду сливают.

6. Формирование концентрирующего геля. Состав концентрирую­щего геля: 1,6 мл раствора К; 0,6 мл раствора В; 5,0 мл воды; 80 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия. Полученный раствор дегазируют 10 минут в пенициллиновом флаконе, затем при помощи шприца наслаивают на разделяющий гель. Сверху вставляют гребенку для формирования карманов.

7. Методика определения.

   1. Для приготовления об­разца смешивают разведенный дистиллированной водой до концентрации 6 мг/мл (0,6 %) препарат с буфером для образ­цов в соотношении 2:1. В одну из проб добавляется кристаллик бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Наносят пробы на гель в количестве 10, 30 и 60 мкг белка на трек. В качестве контрольного образца в один из треков вносят 80 мкг белка нормальной сыворотки крови рогатого скота, свиньи или барана, предварительно смешанной с буфером для образцов в соотношении 2:1. Электрофо­рез проводят при напряжении 120 В до тех пор, пока полоса красителя не доходит до начала градиентного геля. Затем напряжение увеличивают до 450-500 В. Для предотвращения перегрева пластины охлаждающая система должна работать в течение всего электрофореза. Электрофорез прекращают, когда фронт красителя достигнет нижнего края гелевой пластины.

   2. По окончании электрофореза гель переносят на 40 минут в фиксирующий раствор. После фиксирования гель отмывают от фиксирующего раствора в течение 1 часа в дистиллированной воде. Затем гель переносят на 90 минут в раствор для окрашивания, находящийся на водяной бане при температуре 70-80С. Окрашенный гель переносят в раствор для отмывки. По мере ослабления фона раствор несколько раз меняют. Отмывку производят до полного удаления фона. Для более эффективного удаления фонового окрашивания лучше отмывать гель при температуре 70-80 С.

   3. Препарат должен давать мажорную полосу в области альбумина контрольного образца. Допускается наличие нескольких минорных примесных полос.

   4. Электрофоретическую однородность препарата определяют при помощи ден­ситометрирования, по процентному содержанию основной мажорной полосы по отношению к сумме всех окрашенных полос на электрофореграмме. Допускается денситометрирование влажных или высушенных между двумя листами целлофана гелей. Денсититометрируют треки с количеством белка 10, 30 и 60 мкг и для дальнейших расчетов выбирают трек с наибольшей концентрацией, но не дающий чрезмерной оптической плотности в максимуме поглощения мажорной полосы (линейный диапазон измерения определяется инструкцией по эксплуатации денситометра или техническим описанием). Денситометрирование проводят трижды в разных местах трека, при этом необходимо следить за параллельностью направления сканирования осевой линии трека. Интенсивность поглощения полосы определяют по площади соответствующего пика полученного при денситометрировании. Расчет производят по формуле:

(1) , где

S – площадь пика мажорной полосы (альбумин).

Si – суммарная площадь всех пиков полученных при денситометрировании трека.

Электрофоретическую однородность «А» определяют как среднее арифметическое для трех измерений. При таком способе оценке электрофореграммы электрофоретическая однородность препа­рата должена быть не менее 80 %.

5. Допускается также обработка результатов с помощью промышленно выпускаемых систем для анализа электрофоретических изображений таких как «ImageMaster DTS System» (Amersham Pharmacia Biotech) или «Kodak digital science» (SIGMA) или аналогичных. Анализ изображения и определение интенсивности поглощения проводят в соответствии с руководством по эксплуатации используемой системы. Содержание активного компонента определяют по формуле 1.

2. Определение фракционного состава.

1. С целью определения фракционного состава препарата проводят иммуноэлектрофорез в агарозном геле.

2. Сущность метода. Метод основан на способности заряженных макромолекул к перемещению с различной скоростью в агарозном геле под действием электростатического поля. На следующей стадии анализа разделенные фракции сывороточных белков тестируют методом двойной иммунодиффузии. Антисыворотку вносят в траншеи, расположенные параллельно направлению электрофоретического фракционирования. По спектру дуг (линий) преципитации на иммуноэлектрофореграмме с видоспецифической антисывороткой к тотальным белкам сыворотки крови судят о подлинности и фракционном составе препарата.

3. Аппаратура, материалы, реактивы.

Источник тока для иммуноэлектрофореза типа аппарата ПЭФ-3, ТУ5-375-4231-77, либо аналогичный, позволяющий получать стабилизированное напряжение в пределах 50-400 В.

Электрофоретическая камера, предназначенная для проведения горизонтального гель-электрофореза и позволяющая работать с пластинами размером 84х94 мм, снабженная электродными сосудами объемом 1 л с ме­таллическими (платиновыми) электродами. Камера должна быть снабжена охлаждающим столиком. Рекомендуется использовать электрофоретический комплекс «Multiphor» производства фирмы «Amersham Pharmacia Biotech»

рН-метр типа ЭВ-74 или рН-121 с набором стеклянных электродов, з-д измерительных приборов, г. Гомель.

Агароза импортная фирмы «LKB» со средним показателем электроэндоосмоса или «SIGMA» тип II, или аналогичная.

Трис-(оксиметил)-аминометан, C₄H₁₁O₃N, ТУ 6-09-4292-76.

Диэтилбарбитуровая кислота, C₈H₁₂N₂O₃, импорт.

Кислота соляная, HCl, ГОСТ 3118-77.

Амидочерный 10Б, импорт.

Кислота уксусная, CH₃COOH, ГОСТ 61-75.

Вода дистиллированная, Н₂О, ГОСТ 6709-72.

Мертиолят, C₉H₉HgNaO₂S, Германия.

Азид натрия, импортный.

4. Приготовление рабочих растворов.

1. Приготовление концентрата трис-барбиталового буферного раствора (рН 8,6). 22,4 г диэтилбарбитуровой кислоты, 44,3 г триса и 0,5 мг мертиолята помещают в мерную колбу и доводят объем раствора дистиллированной водой до 1 л.

2. Приготовление рабочего трис-барбиталового буферного раствора. К 200 мл концентрата трис-барбиталового буфера приливают 800 мл дистиллированной воды.

3. Приготовление 1,0%-ного раствора агарозного геля. 10 г агарозы помещают в химический стакан вместимостью 1 л, приливают 1000 мл трис-барбиталового рабочего буферного раствора (pH 8,6) и оставляют на 1 час для набухания при температуре 18-20 С. Затем стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню, периодически перемешивая стеклянной палочкой и выдерживают до полного расплавления агарозы. Объем раствора геля доводят дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор агарозы фильтруют через марлю (2-3 слоя), прибавляют мертиолят до концентрации 200 мкг/мл и разливают в градуированные пробирки по 12 мл (количество необходимое на 1 пластину). Расплавленная агароза должна быть прозрачной и однородной.

4. Приготовление 0,5%-ного раствора агарозного геля. 2,5 г агарозы помещают в химический стакан вместимостью 0,5 л, приливают 500 мл дистиллированной воды и оставляют на 1 час для набухания при температуре 18-20 С. Затем стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню, периодически перемешивая стеклянной палочкой и выдерживают до полного расплавления агарозы. Объем раствора геля доводят дистиллированной водой до 500 мл. Раствор агарозы фильтруют через марлю (2-3 слоя), прибавляют мертиолят до концентрации 200 мкг/мл и разливают в градуированные пробирки по 12 мл (количество необходимое на 6 пластин). Расплавленная агароза должна быть прозрачной и однородной.

5. Приготовление красителя. Амидочерный 10Б - 1,0 г, 70 мл ледяной уксусной кислоты доводят дистиллированной водой до 1 л.

6. Приготовление 7%-ного раствора уксусной кислоты. 70 мл ледяной уксусной кислоты вносят в мерный цилиндр вместимостью 1 л, объем доводят дистиллированной водой до метки.

1. Обработка стеклянных пластин. На тщательно вымытые и обезжиренные стеклянные пластины, установленные строго горизонтально наносят 2 мл расплавленной 0,5%-ной агарозы и при помощи стеклянной палочки дают ей растечься по всей поверхности стекла. После застывания агарозы пластину высушивают при температуре 65-75С. Эта операция необходима, чтобы агарозный гель лучше прилипал к стеклу.

2. Методика определения.

   1. На стеклянную пластину размером 94х84 мм, установленную строго горизонтально, наливают 12 мл расплавленной агарозы концентрации 1%, чтобы получился слой толщиной 1,5-2 мм.

   2. Лунки для антигена вырезают при помощи полой трубки с остро отточенным краем и внешним диаметром 2 мм (см. рис.1). Препараты вносят в лунки при помощи микропипетки. Лунка заполняется исследуемым образцом полностью. Исследуемый препарат предварительно разводят в 2 раза рабочим трис-барбиталовым буферным раствором (рН 8,6). В одну из лунок вносят приготовленную аналогичным образом нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота, барана или свиньи (контрольный образец).

   3. В электродные камеры наливают рабочий трис-барбиталовый буферный раствор (рН 8,6). Пластинки с агарозным гелем помещают в аппарат для электрофореза. На оба конца гелевой пластины помещают полоски фильтровальной бумаги размером 127х84 мм, сложенной в 5-6 слоев, которые соединяются с электродными камерами. Перекрывание гелевой пластины бумажным фитилем должно составлять 8-10 мм. Электрофорез проводят при напряжении 300 В в течении 1,0-1,5 ч.

   4. После проведения электрофореза на равном расстоянии от лунок параллельно движению разделяемых компонентов вырезают траншеи для преципитирующей антисыворотки. Ширина траншеи 2 мм, длинна – 56 мм. Графическая схема пластины представлена на рисунке 1. Траншеи вырезают остро отточенным скальпелем, лунки для антигена вырезают при помощи полой трубки с остро отточенным краем и внешним диаметром 2 мм. Лунки и траншеи можно вырезать, положив пластину на бумагу с нанесенным рисунком или используя трафарет.

Р исунок 1. Схема расположения лунок и траншей на агарозной пластине

5. В траншеи вносят по 100 мкл антисыворотки, преципитирующей сывороточные белки. Пластину помещают во влажную камеру. Через 24-48 часов пластину вынимают из влажной камеры, погружают в кювету с 0,15 моль/л раствором натрия хлорида (консервант - 0,1% азид натрия ) и отмывают в течение 2 суток от белка, не принявшего участие в образовании преципитата. Раствор меняют 3-4 раза в сутки.

6. Отмытые пластины отжимают. Для этого траншеи и лунки высушивают с помощью фильтровальной бумаги и затем заливаются расплавленной агарозой. Пластинку с агарозным гелем накрывают фильтровальной бумагой, смоченной водой, края бумаги должны выступать за края пластины на 1 см, и сухой фильтровальной бумагой, сложенной в 5-6 слоев, накрывают стеклом и ставят груз массой 1 кг. Через 15-20 мин пластину с гелем погружают в кювету с дистиллированной водой и отмывают 0,5 ч. Затем снова отжимают таким же образом. Далее пластины досушивают в сухожаровом шкафу при температуре 70-75С.

7. Пластины с высушенным агарозным гелем окрашивают в течении 30 минут в растворе красителя.

8. Избыток красителя удаляют 7%-ым раствором уксусной кислоты до полного отсутствия фона.

9. Препарат оценивают по локализации и числу линий преципитации. Препарат должен образовывать мажорную дугу преципитации в области белков с альбуминовой подвижностью. Допускается не более трех минорных дуг преципитации с бета- и альфа-глобулиновой подвижностью. При этом область белков с альбуминовой электрофоретической подвижностью определяется по контрольному образцу. Контроль используемой антисыворотки проводят на основании подсчета линий преципитации с нор­мальной сывороткой крови - их должно быть не менее 15.

2. Определение содержания полимеров и фрагментов альбумина

1. Сущность метода. Анализ основан на разделении белков пре­парата по их молекулярным массам с помощью эксклюзионной хроматографии на импортном или отечественном геле типа сефадекс G-200.

2. Аппаратура, материалы, реактивы.

Спектрофотометр типа СФ-46, или СФ-16, или СФ-24, произ­водства "ЛОМО".

Хроматографическая колонка с геометрией (9010)(2,60,2) см, оте­чественная или импортная, типа XK 26/100 или аналогичная. Можно использовать стеклянную трубку соответствующей геометрии, приспособленную под колонку. Использование адаптеров обязательно.

Коллектор фракций лабораторного (пробирочного) типа оте­чественного или импортного производства, рассчитанный на количество фракций не менее 100 и пробирки не менее 5 мл. Рекомендуется использовать Ultrorac II (Pharmacia), FRAC-200 (Amersham Pharmacia Biotech) или аналогичный.

Гель импортный типа сефадекс G-200 (Pharmacia).

Натрия хлорид, NaCl, ГОСТ 4233-77.

Голубой декстран, Sigma, США.

Раствор альбумина 5, 10, 20 %, ФС 42-3543-98.

Мертиолят, C₉H₉HgNaO₂S, Германия.

Вода дистиллированная, H₂O, ГОСТ 6709-72.

3. Методика определения.

В колонку (9010)(2,60,2) см с гелем сефа­декс G-200 (или его аналогом) вносят 1-3 мл 2,5%-ного раствора препа­рата. С помощью сосуда Мариотта устанавливают гидростатическое давление 10-15 см, при котором скорость элюирования находится в пределах (17+2,5) мл/ч. В качестве элюирующего раствора используется 0,15 моль/л раствор хлорида натрия. Объем элюата в каждой пробирке составляет 5 мл. Вре­мя фракционирования определяют в зависимости от объема элюата, соответствующего полному объему колонки. В каждой пробирке измеря­ют оптическую плотность (ОП) на спектрофотометре при длине волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Распределение белковых фракций выра­жают графически. Сливают в отдельные емкости содержимое пробирок, со­ответствующих каждой фракции препарата, измеряют их объем и определяют оптическую плотность. Если величина оптической плотности превышает оп­тимальную зону измерений (т.е. более 1,0), то делают разведение бе­лок-содержащего раствора. Рассчитывают суммарную оптическую плотность для каждой фракции (ОПфр) препарата по формуле:

ОП_фр = ОП₂₈₀  V_фр  n (2) , где

ОП_фр - оптическая плотность фракции,

V_фр - объем фракции,

n - разведение.

Перед проведением анализа колонку калибруют по мертиоляту, препарату «Раствор альбумина 5, 10, 20 %» и голубому декстрану В хроматографическом профиле препарата определяют полимерную фракцию по объему выхода голубого декстрана, мономерную фракцию по объему выхода основного пика препарата «Раствор альбумина 5, 10, 20 %»; фрагментами и низкомолекулярными примесными белками считаются пики, объем выхода которых больше объема выхода основного пика препарата «Раствор альбумина 5, 10, 20 %» и меньше, чем объем выхода мертиолята. Сумму оптических плотностей всех хроматографических фракций принимают за 100%, не учитывают при этом фракции, объем выхода которых равен объему выхода мертиолята. Процентное содержание отдельной фракции вычисляют по отношению к полученной сумме. Препарат должен состоять в основном из белков с молекулярной массой альбумина. Содержание полимерной фракции должно быть не более чем 10%, фрагментов альбумина и низкомолекулярных примесных белков должно быть не более 1%.

2. Определение концентрации ионов водорода, pH

Определение проводят потенциометрически, по методике, изложенной в ГФ XI, вып.1, с.113. рН в препарате должен быть в пределах 7,0+0,4.

2. Определение массовой доли белка

1. Определение массовой доли белка с помощью спектрофотометрического метода.

   1. Сущность метода. Метод основан на эффекте поглощения ультрафиолетового света ароматическими аминокислотами белка.

   2. Аппаратура, материалы, реактивы.

Спектрофотометр типа СФ-16, СФ-24 или СФ-46 произ­водства "ЛОМО" (г. Санкт-Петербург).

Вода дистиллированная, Н₂О, ГОСТ 6709-72.

Натрия хлорид, NaCl, ГОСТ 4233-77.

Приготовление 0,15 моль/л раствора хлорида натрия. Навеску 0,876 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют в 40-60 мл дистиллированной воды. Дистиллированной водой объем доводят до метки, перемешивают.

3. Методика определения.

К препарату объемом 0,1 мл приливают 9,9 мл 0,15 моль/л раствора хлорида натрия, перемешивают и фотометри­руют в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм на спектрофотометре типа СФ-46 в ультрафиолетовой области при длине волны 280 нм. В качестве контрольной пробы используют 0,15 моль/л раствор хлорида натрия. Концентрацию белка в растворе рассчитывают по формуле:

В _{(мг белка/мл раствора)} = ОП₂₈₀/0,6 (3) , где

В - концентрация белка в мг на мл разведенного в 100 раз препарата;

ОП₂₈₀ - оптическая плотность разведенного в 100 раз пре­парата при длине волны 280 нм.

Процентное содержание белка рассчитывают по формуле:

C = B  10, где

C - количество граммов белка в 100 мл препарата,

B - концентрация белка мг/мл при разведении препарата в 100 раз.

Содержание белка в препарате должно быть от 5 до 7 %.

2. Определение массовой доли белка с помощью биуретового метода

1. Сущность метода. Метод основан на специфической реакции пептидной связи с ионами меди в щелочной среде.

2. Аппаратура, материалы, реактивы.

Спектрофотометр типа СФ-16, СФ-24 или СФ-46 произ­водства "ЛОМО" (г. Санкт-Петербург), или фотоэлектроколориметр типа КФК 2М, КФК 3М, Оптико-механический завод (г. Загорск).

Вода дистиллированная, Н₂О, ГОСТ 6709-72.

Натрия хлорид, NaCl, ГОСТ 4233-77.

Медь (II)сернокислая 5-водная, CuSO₄5H₂O, ГОСТ 4165-78.

Натрия гидроокись, NaOH, ГОСТ 4328-77.

Калий-натрий тартрат 4-водный, C₄H₄KNaO₆5H₂O, ТУ 6-092677-89.

Калий йодистый, KI, ГОСТ 4232-74.

Альбумин бычий сывороточный (фракция V), импортный (США).

3. Приготовление рабочих растворов

   1. Приготовление биуретового реактива. В 80 мл дистиллированной воды растворяют 0,75 г сульфата меди и 3 г виннокислого натрия-калия, за­тем при энергичном перемешивании добавляют 150 мл 10%-ного раствора натриевой щелочи и 1,0 г иодистого калия. Общий объем дово­дят дистиллированной водой до 1000 мл. Реактив хранят в полиэтиленовом сосуде при температуре +4 ⁰С.

   2. Приготовление калибровочного раствора. Навеску 30 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 3 мл 0,15 моль/л раствора хлорида натрия.

4. Построение калибровочной кривой. В шесть химических пробирок приливают 1%-ый раствор БСА по 100, 200, 300, 400, 500, 600 мкл. Затем приливают по 900, 800, 700, 600, 500 и 400 мкл дистиллированной воды соответственно, получая, таким образом, концентрации 1, 2, 3, 4, 5, 6 мг/мл. Общий объем в каждой пробирке должен быть 1 мл. Затем добавляют 4 мл биуретового реактива. Содержимое про­бирок перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Интенсивность окраски определяют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм. Измерения проводят относительно кюветы, содержащей 1 мл 0,15 моль/л раствора хлорида натрия и 4 мл биуретового реактива. Полученные данные изображают графически, откладывая по оси абсцисс величину оптической плотности, а по оси ординат - количество белка, которое соответствует этой величине.

5. Методика определения.

   1. В две конические пробирки на 10 мл вносят последовательно 100, 50 мкл препарата и доводят объем в каждой пробирке до 1 мл, добавляя соответственно 900, 950 мкл 0,15 моль/л раствора хлорида натрия. Таким образом, получают разведения кратностью 10, 20 раз.

   2. В каждую пробирку приливают по 4 мл биуретового реактива. Перемешивают встряхиванием. Выдерживают 30 минут при комнатной температуре, а затем определяют оптическую плотность при длине волны 540 нм и толщине кюветы 10 мм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре. Изменения проводят относительно кюветы, содержащей 1 мл 0,15 моль/л раствора хлорида натрия и 4 мл биуретового реактива. Используя калибровочный график, определяют концентрацию белка в каждой пробирке (С1). Рассчитывают концентрацию белка в препарате (С2) в мг/мл по формуле:

, где

n – кратность разведения.