5. Спорообразование

Образование эндоспор, способность к которому в норме никогда не проявляется при вегетативном росте спорообразующих бактерий, представляет собой чрезвычайно сложный про­цесс дифференцировки, начинающийся во всей популяции, когда она выходит из экспоненциальной фазы роста и переходит в стационарную фазу. Этот процесс приводит к образованию внутри большинства вегетативных клеток новых клеток, полностью отличающихся от материнских по тонкой структуре, химическому составу и физиологическим свойствам. После высвобождения из материнской клетки эндоспора в норме вступает в долгий период покоя, однако при соответствующих условиях прорастает и развивается в типичную вегетативную клетку. Проблема образования и прорастания эндоспор всесторонне исследовалась многими микробиологами. Мы же ограничимся лишь кратким обзором обширной -литературы по этому вопросу. Из соображений удобства большинство экспериментальных работ по эндоспорам проведено с представителями рода Bacillus, однако образование и прорастание эндоспор у всех анаэробных спорообразующих бактерий происходит, насколько об этом можно сейчас судить, в принципе одинаковым образом.

Морфологические изменения, связанные с образованием спор обобщены на рисунке.1.

В момент перехода культур от экспоненциальной к линейной фазе роста — периоду, непосредственно предшествующему началу споруляции, — каждая клетка содержит два нуклеоида. Эти нуклеоиды объединяются, образуя палочковидную структуру. Первым видимым признаком начала спо-рообразования является возникновение поперечной перегородки около одного из полюсов клетки; эта перегородка отделяет цитоплазму и ДНК меньшей по размеру клетки, которой предстоит превратиться в спору, от остального клеточного содержимого. В отличие от того, как это бывает при обычном делении. Затем мембрана большей клетки быстро обволакивает малую, которая оказывается полностью окруженной цитоплазмой большей клетки. В результате образуется так называемая проспора. Фактически проспора представляет собой протопласт с двумя концентрическими слоями обычных мембран: собственной мембраной и мембраной материнской клетки, окружившей ее. На этой стадии процесс развития становится необратимым: можно сказать, что клетка «обязалась» осуществить споруляциях. Под световым микроскопом проспора выглядит как непреломляющая свет область, свободная от гранулярных включений.

Рисунок 1. Схематическое изображение цитологических изменений, сопровождающих образование эндоспоры у Bacillus cereus.

А. Вегетативная клетка с двумя нуклеоидами (н). Б. Конденсация нуклеоидов с образованием палочковидной структуры. В. Начало формирования поперечной перегородки. Г. Завершение формирования попереч­ной перегородки, в результате чего проспора и ее нуклеоид оказываются изолированными от вегетативной клетки. Д. Образование новой оболочки вокруг проспоры. Е. Завершение образования оболочки. Ж. Созревание споры. 3. Высвободившаяся спора, окруженная неплотной наружной оболочкой экзоспориумом. м — клеточная мембрана, кс—клеточная стенка.

Сразу же после «поглощения» проспоры материнской клеткой происходит быстрый синтез и формирование новых структур, окружающих ее. Первым появляется кортекс, который развивается между внутренней и наружной мембранами; вскоре после этого поверх наружной мембраны начинает формироваться более электроноплотный слой, оболочка споры. У бактерий группы В. cereus вокруг оболочки образуется еще один, менее плотный и более тонкий слой, экзоспориум. После завершения формирования обо­лочки у созревающей споры начинает возрастать показатель преломления. В это время, однако, она еще не термостабильна. Это свойство спора приобретает вскоре после двух основных химических изменений: интенсивного поглощения спорулирующими клетками ионов Са²⁺ и синтеза больших количеств дипиколиновой кислоты — вещества, отсутствующего в вегетативных клетках.

Наружная оболочка споры, составляющая от 30 до 60% ее веса, состоит в основном из белков, на долю которых приходится до 80% всех белков споры. Белки оболочки обладают необычно высоким содержанием цистеина и гидрофобных аминокислот и чрезвычайно устойчивы к различным воздействиям, приводящим к растворению большинства белков.

В протопласте зрелой споры содержится очень много дипиколината кальция, а сам протопласт окружен новосинтезированными наружными слоями уникальной химической структуры (кортексом, оболочкой и иногда экзоспориумом). Высвободившаяся в результате автолиза материнской клетки эндоспора сильно обезвожена, не проявляет заметной метаболической активности и надежно защищена от тепловых и радиационных повреждений, а также от химических и ферментативных воздействий. Она остается в таком криптобиотическом состоянии до тех пор, пока ряд внешних воздействий не инициирует ее превращение в новую вегетативную клетку.

Образование эндоспоры — основное, но отнюдь не единственное изменение в спорулирующей клетке. Одно из таких примечательных явлений, свойственное Bacillus thuringensis, заключается в обра­зовании по соседству с каждой спорой бипирамидального белкового кристаллика. Описаны также разнообразные не­кристаллические околоспоровые структуры определенной формы у других видов Bacillus и у Clostridium.

У многих спорообразующих бактерий, как аэробных, так и анаэробных, начало споруляции сопровождается синтезом особого класса антимикробных веществ — пептидов с мол весом около 1400. Многие из этих пептидных антибиотиков охарактеризованы и химически, и функционально. Их можно разделить на три класса: эдеины — линейные основные пептиды, подавляющие синтез ДНК, бацитрацины — циклические пептиды, подавляющие, синтез клеточных стенок, и группу грамицидин — полимиксин — тироцидин, состоящую из линейных и циклических пептидов, которые влияют на структурные и функциональные свойства мембран. Пептидные антибиотики синтезируются на относительно ранних этапах образования спор с помощью особого механизма полимеризации, при котором последовательность аминокислот определяется белком-ферментом; ни тРНК, ни рибосомы в этом процессе не участвуют. Роль указанных соединений в споруляции неизвестна, но предполагается, что они могут регулировать различные стадии процесса дифференцировки.

АКТИВАЦИЯ, ПРОРАСТАНИЕ И ДАЛЬНЕЙШЕЕ РАЗВИТИЕ СПОР

Только что сформировавшиеся эндоспоры остаются, как правило, покоящимися даже в условиях, оптимальных для прорастания. Из состояния покоя их можно вывести рядом воздействий, приводящих к так называемой активации. Вероятно, наиболее общим способом активации спор является тепловая обработка — прогрев спор в течение нескольких часов при высокой сублетальной температуре, например 65°С. Гораздо более медленная активация происходит при хранении спор как при относительно низкой температуре (5°С), так и в сухом состоянии. Эта активация необратима; по мере хранения доля спор в популяции, способных к прорастанию, возрастает.

Когда активированные споры помещают в благоприятные условия, происходит их прорастание. Процесс протекает очень быстро и проявляется в резком снижении показателя преломления спор, потере устойчивости их к нагреванию и другим вредным воздействиям, а также восстановлении ме­таболической активности, о чем свидетельствует внезапно возникающее дыхание. Эти процессы сопровождаются выделением в растворенном виде до 30% (по весу) веществ споры. Выделения состоят в основном из дипиколината кальция, высвобождающегося из протопластов спор, и фрагментов пептидогликана кортекса. Кортекс быстро разрушается, и остается только наружная оболочка споры. Для прорастания активированной споры необходим химический пусковой механизм; роль инициаторов этого процесса играют самые разнообразные вещества, включая L-аланин, рибозиды (аденозин, инозин), глюкозу, дипиколинат кальция и различные неорганические анионы и катионы. Специфические условия, необходимые для прорастания спор, часто меняются от вида к виду; для получения максимальной эффективности иногда необходимо сочетание нескольких веществ. Кроме того, прорастание спор можно вызвать, подвергая их физическим воздействиям, вызывающим эрозию или образование трещин в оболочке.

Процесс прорастания, по-видимому, не сопровождается синтезом макромолекул. Появление метаболической активности обусловлено активацией в протопласте споры предшествующих, но неактивных до этого ферментов. Если спора прорастает в среде, не содержащей питательных веществ, необходимых для вегетативного роста, дальнейшего развития споры не происходит; при наличии же питательных веществ, необходимых для синтеза макромолекул, прорастающая спора превращается в вегетативную клетку. При этом сначала спора набухает, а вслед за этим быстро образуется стенка вегетативной клетки, нижний слой которой, окружающий протопласт споры, может присутствовать уже во время прорастания. Новообразованная вегетативная клетка выходит из оболочки споры, удлиняется и приступает к первому вегетативному делению.