Обозначения

Ration of bcl-2 and bax mRNA	Соотношение мРНК bcl-2 и bax
b-actin	Бета-актин
Control	Контрольная группа
Con A	Кон А
Laennec treated	Введение Лаеннек

Рисунок 7. Влияние препарата Лаеннек на экспрессию мРНК bcl-2 и bax в гепатоцитах.

Полоса 1 – группа Кон А (10 мг/кг), полоса 2 – группа Кон А+ Лаеннек (3,6 мл/кг), полоса 3 – контрольная группа.

*p<0,05 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Обозначения

Expression of ICAM-1 mRNA (b-actin)	Экспрессия мРНК ICAM-1 (бета-актин)
Control	Контрольная группа
Medium stimulated group	Группа, получившая стимуляцию средой
Laennec treated group	Группа, получившая Лаеннек

Рисунок 8. Влияние препарата Лаеннек на экспрессию мРНК ICAM-1 в гепатоцитах

Свежие изолированные гепатоциты (2,5X10⁵) высевали в 24-ячейковый планшет, через 24 часа тщательно убирали среду с помощью надосадочной жидкости, полученной из лимфоцитов, обработанных препаратом Кон А (20 мг/мл). Гепатоциты предварительно обрабатывали препаратом Лаеннек (1 мл/мл) за 1 ч до добавления лимфоцитов.

Полоса 1 – контрольная группа, полоса 2 – группа, получившая стимуляцию средой, полоса 3 – группа, предварительно получившая Лаеннек (1мл/мл).

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившая стимуляцию средой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартное отклонение.

Обозначения

Grey level of ICAM-1 expression	Серый уровень экспрессии ICAM-1
Control	Контрольная группа
Medium stimulated group	Группа, получившая стимуляцию средой
Laennec treated group	Группа, получившая Лаеннек

Рисунок 9. Иммунногистохимическое окрашивание ICAM-1в гепатоцитах.

Клетки, окрашенные в коричневый цвет, считались положительным результатом. Серый уровень отражает степень экспрессии ICAM-1 и показывает обратно-пропорциональную связь между ними. Фото A—C увеличение X200, полоса=50 мм. ##p<0.01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившая стимуляцию средой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартное отклонение.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы исследовали влияние препарата Лаеннек на цитотоксичность в печени, индуцированную препаратом Кон А, и возможный молекулярный механизм этого влияния in vivo и in vitro. Полученные нами результаты показывают, Лаеннек значительно подавлял активность цитоплазматических ферментов (АЛТ, ЛДГ, МПО, NO) и восстанавливал показатели параметров, связанных с окислением (СОД и МДА). В то же самое время препарат Лаеннек ингибировал апоптоз в гепатоцитах, индуцированный Кон А. Кроме того, наши результаты также показывают, что Лаеннек подавлял экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах, что позволяет предположить, что Лаеннек участвует в регулировании молекул, связанных с иммунитетом.

Результаты исследования in vivo показывают, что предварительное введение препарата Лаеннек значительно улучшает состояние при остром поражении печени, индуцированном препаратом Кон А, что видно по снижению активности АЛТ и ЛДГ (Рис. 1). В соответствии с результатами исследования in vivo, Лаеннек также подавляет цитотоксичность, вызванную взаимодействием между гепатоцитами, обработанными Кон А, и лимфоцитами селезенки, стимулированными Кон А (Рисунок 2).

Считается, что ICAM-1/LFA-1 играет решающую роль в индукции апоптоза через Fas/перфорин-опосредованный путь при цитотоксичности, опосредованной Т-клетками (15, 16). Наличие антител к ICAM-1/LFA-1 почти полностью устраняет повреждение печени in vivo и частично подавляет цитотоксичность (примерно на 50%) in vitro (13), что означает, что в упомянутом взаимодействии участвуют и другие молекулы. Из более ранних публикаций видно, что Кон А связывается с главным комплексом гистосовместимости (ГКГС) мышей, чтобы имитировать его антигенные свойства (17), что объясняет, почему активированные Т-клетки распознают только гепатоциты, активированные Кон А (13). Таким образом, как связывание Кон А с гепатоцитами, так и взаимодействие ICAM-1/LFA-1 играет важную роль в развитии цитотоксичности печени, а это служит главным теоретическим обоснованием нашей модели in vitro (цитотоксичность, индуцированная взаимодействием между гепатоцитами, обработанными Кон А, и лимфоцитами, активированными Кон А. Цитотоксичность, индуцированная взаимодействием между гепатоцитами и лимфоцитами, значительно снижается благодаря предварительному введению препарата Лаеннек. Планируются дополнительные исследования, чтобы узнать, регулирует ли препарат Лаеннек экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах. Воспалительные цитокины апрегулируют экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах (20) и при адгезии Т-лимфоцитов (18, 19). Цитокины, полученные из активированных лимфоцитов при совместной культивации с лимфоцитами, обработанными препаратом Кон А, обязательно повлияют на гепатоциты. В связи с этим мы использовали лимфоциты, обработанные препаратом Кон А (20 мг/мл), чтобы индуцировать экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах. Результаты исследования in vitro показали, что Лаеннек даунрегулировал экспрессию ICAM-1 либо на генном (Рис. 7) , либо на белковом уровне (Рис.8). Это может объяснять повышенную выживаемость гепатоцитов в совместных культурах гепатоцитов и лимфоцитов (Рис. 2).

Лаеннек подавлял перекисное окисление липидов и повышал уровень антиоксидантов. Во время воспаления нейтрофилы и клетки Купффера производят несколько видов реактивного кислорода, который вызывает перекисное окисление липидов (20). Хотя выраженность перекисного окисления липидов in vivo недостаточна для прямого повреждения клеток, перекисное окисление липидов – это мощный хемотаксический фактор нейтрофилов, который участвует в рекрутинге нейтрофилов и в ухудшении поражения печени (21, 22). Как показывают результаты нашего исследования in vivo, препарат Лаеннек повышал активность СОД и снижал уровень МДА в тканях печени мышей, получивших Кон А (Рис. 3). Это, а также то, что Лаеннек даунрегулировал экспрессию ICAM-1, помогает объяснить ингибирование апоптоза in vivo (Рис. 6, 7). Белок bcl-2 – это антиапоптозный фактор, а bax инактивирует bcl-2, связываясь с ним и образуя гетеродимер. Соотношение мРНК bcl-2 к bax – это ключевой фактор, позволяющий определить, будет ли апоптоз происходить в клетках или нет (23, 24). NO опосредует повреждение тканей путем ингибирования митохондриального дыхания, инактивации ингибиторов протеиназы и образования свободных радикалов (25), то есть NO – это весьма токсичное для клеток вещество. Предварительное введение препарата Лаеннек значительно снижало содержание NO в печени, что значимо снижало повреждение печени, в сравнении с контрольной группой. Кроме того, Лаеннек значительно снижал уровень МПО, повышенный вследствие приема препарата Кон А in vivo (Рис. 4). А это значит, что Лаеннек снижал инфильтрацию лейкоцитов в месте воспаления. Все упомянутые выше результаты показывают, что Лаеннек может оказывать гепатопротекторное действие, улучшая активность эндогенного антиоксидантного фермента.

В заключении можно сказать, что Лаеннек оказывает защитное действие при повреждениях печени, индуцированных введением препарата Кон А in vitro и in vivo, возможно, благодаря подавлению воспалительных реакций и апоптоза. Кроме того, Лаеннек также даунрегулирует экспрессию ICAM-1. Наши результаты дают новое понимание механизмов действия препарата Лаеннек как антигепатитного средства при иммунно-опосредованном гепатите, а дальнейшие исследования дадут болшье информации, которая позволит установить его безопасность и клинические возможности.