Использование препарата Лаеннек оказывает защитное действие при повреждениях печени у мышей, вызванных приемом препарата Конканавалин А, благодаря ингибированию воспалительных реакций и апоптоза гепатоцитов.

Цзинцзин У^а, Тао ЯНГ^а, Чаньгуань ВАН^а, Ци Лю^а, Цзихон ЯО^а, Хуйцзунь СУНЬ^а, Тай-ичи КАКУ^b, Ке-Син ЛЮ^а

А – факультет клинической фармакологии, фармацевтический институт, Далянский медицинский институт, Liaoning, 9 West Section, Lvshun South Road, Lvshunkou District, Dalian 116044,КНР и bДжапан Байопродактс Индастри Ко Лтд, 1-44-4 Tomigaya, Shibuya-ku, Tokyo 151-0063, Япония

Получено: 11 апреля 2008 года

Принято в печать: 8 августа 2008 года

Опубликовано в сети Интернет: 20 августа 2008 года.

Действие препарата Лаеннек, гидролизата человеческой плаценты, при иммунно-опосредованных повреждениях печени исследовали in vivo и in vitro на мышах. Для провокации повреждения печени in vivo использовали препарат Конканавалин А, который вводили в хвостовую вену. Гепатотоксичность in vitro изучали после взаимодействия между гепатоцитами, которые обработали Кон А, и аутологичными селезеночными лимфоцитами, стимулированными Кон А, в течение 8 часов. В обоих случаях заранее вводили Лаеннек. Лаеннек снижал активность биохимических маркеров (аланин аминотрансферазы – АЛТ, лактат дегидрогеназы – ЛДГ) в сыворотке крови и восстанавливал активность супероксиддисмутазы (СОД) и миелопероксидазы (МПО), а также содержание малондиальдегида (МДА) и оксида азота (NO) в тканях печени. Мы также обнаружили, что Лаеннек уменьшает фрагментацию ДНК, индуцированную Кон А in vivo. Кроме того, просачивание аспартат аминотрансферазы (АСТ) и ЛДГ в надосадочную жидкость в системе кокультивирования уменьшается после добавления препарата Лаеннек. Анализ фрагментации ДНК и эксперимент по индукции/ингибированию молекулы межклеточной адгезии - 1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule - 1) раскрыли возможный защитный механизм препарата. Результаты исследования показали, что Лаеннек ингибирует ICAM-1, которая связана с взаимодействием между гепатоцитами и лимфоцитами. Эти результаты указывают, что Лаеннек обладает мощным действием при иммунно-опосредованных повреждениях печени.

Ключевые слова: Лаеннек; гепатит, вызванный примемом Конканавалина А; апоптоз; молекула межклеточной адгезии – 1

В последние годы стало очевидно, что человеческая плацента – это источник большого количества биологически активных молекул (1), например, фактора роста гепатоцитов (ФРГ) (1,4), эпидермальный фактор роста (ЭФР) (5), трансформирующий ростовой фактор – альфа (ТРФ-а) и трансформирующий ростовой фактор неразборчиво (ТРФ - ??) (7). Лаеннек получает путем очищения человеческой плаценты; процесс очищения включает диализ, тепловую обработку и гидролиз. Хотя Лаеннек представляет собой смесь нескольких анионных кислот, но не содержит ФРГ, он в значительной мере стимулирует регенерацию печени in vivo и in vitro (8), что позволяет предположить наличие мощных митогенов для гепатоцитов в составе препарата Лаеннек. Инъекции Лаеннека использовали в Японии в клинической практике для лечения хронического повреждения печени и цирроза печени на протяжении 40 лет. Однако о его антииммунном действии известно немногое, таким образом, разработка этого нового фарамакологического действия представляет большую ценность.

Конканавалин А (Кон А) индуцирует селективную печеночную недостаточность, которая характеризуется наличием поликлонально активированных Т-клеток, за которой следует системное высвобождение цитокинов (9-11). Как сообщалось ранее, Кон А прочно связывается с мембраной гепатоцитов, что согласуется со степенью гепатотоксичности, вызванной приемом препарата Кон А (12). Это происходит потому, что связывание с Кон А не только производит прямой токсический эффект на первичные гепатоциты независимо от наличия Т-клеток, но и повышает чувтсвительность гепатоцитов к ативированным аутологичным лимфоцитам (13). Как активация лимфоцитов, так и связывание гепатоцитов с Кон А важны для развития цитотоксичности. Гепатоциты сначала сенсибилизируются препаратом Кон А или даже погибают вследствие введения Кон А в большой концентрации, а затем взаимодействуют с поликлонально активированными Т-клетками, что приводит к апоптозу и даже к некрозу. Взаимодействие между гепатоцитами и лимфоцитами, в основном, опосредуется взаимодействием между молекулой межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и LFA-1 (интегрином αLβ2). (13) До некоторой степени, патогенез этой модели гепатита напоминает иммунно-опосредованный гепатит у человека, например аутоиммунный и вирусный гепатит.

Настоящее исследование проводили для изучения защитного действия препарата Лаеннек при гепатите, индуцированном Кон А. Результаты исследования in vivo и in vitro показали, что профилактическое введение препарата Лаеннек значительно улучшает состояние при повреждениях печени благодаря снижению воспалительной реакции и ингибированию апоптоза гепатоцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и реактивы. Самки мышей линии BALB/с и самки крыс линии Вистар (из Центра экспериментальных животных Далянского медицинского университета, Далян, Китай) содержались в строгом соответствии с принципами Национального учреждения здравоохранения по проведению экспериментов с использованием животных. Препарат Кон А и коллагеназу получили из компании Вако (Япония); препарат Лаеннек закупили в компании Джапан Байопродактс Индастри Ко Лтд (Токио, Япония). Противо-крысиное антитело к ICAM-1 приобрели в компании Бостер Байолоджикал Текнолоджи Ко Лтд (Ухань, Китай). Информация о других реактивах будет приведена далее при их упоминании в тексте.

Протокол исследования. In vivo. Повреждение печени у мышей индуцировали с помощью инъекции препарата Кон А (10 мг/кг), растворенного в физиологическом растворе, в хвостовую вену. Препарат Лаеннек вводили внутримышечно животным за 30 минут до введения препарата Кон А. Повреждение гепатоцитов исследовали через 8 ч после приема Кон А. Мышам из контрольной группы вводили тот же объем физиологического раствора.

In vitro. Изолировали гепатоциты, полученные от самок крыс линии Вистар, массой тела 130-160 г, с помощью двухэтапного метода перфузии с коллагеназой (14). У той же крысы удаляли сеслезенку, из которой добывали лимфоциты с помощью раствора для сепарации лифмоцитов (Лимфоцит-Крыса, Тьяньцзинь Хаоян Байо Ко Лтд, Китай). Смесь лимфоцитов инкубировали в течение 3 ч для адгезии клеток, а затем слипшиеся клетки удаляли. Гепатоциты предварительно обрабатывали препаратом Кон А (20 мг/мл). Через 24 часа аутологичные лимфоциты (1.25 X10⁷ клеток/мл), активированные препаратом Кон А (20 мг/мл) в течение 48 часов, добавляли к гепатоцитам, а затем инкубировали их совместно в соотношении лимфоцитов/гепатоцитов 10:1 в течение 8 ч. В эксперименте с ICAM-1 консервированную надосадочную жидкость от лимфоцитов, активированных препаратом Кон А (20 мг/мл) добавляли к гепатоцитам и инкубировали в течение 8 ч (группа, получившая стимуляцию средой). С помощью препарата Лаеннек (1 мл/мл) предварительно обрабатывали гепатоциты за 1 ч до добавления препарата Кон А.

Определение просачивания биохимических маркеров

Образцы сыворотки крови мышей собирали через 8 ч после введения препарата Кон А, а в коцне периода инкубирования собирали надосадочную жидкость. Активность аланин аминотрансферазы (АЛТ) и лактат дегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови и надосадочной жидкости определяли с помощью стандартных аналитических наборов, доступных на рынке (Биоинженерный институт Нанкин Цзяньчэн, Нанкин, Китай). Исследования проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Определение супероксиддисмутазы (СОД), малондиальдегида (МДА), миелопероксидазы (МПО) и оксида азота (NO) в тканях печени.

Получали образцы печени, которые потом взвешивали и гомогенизировали на льду через 8 ч после приема Кон А. Исследования СОД, МДА, МПО и NO проводили с помощью аналитических наборов (Биоинженерный институт Нанкин Цзяньчэн, Нанкин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Белок определяли с помощью метода Лоури.

Скорость ингибирования (I) рассчитывали с помощью следующей формулы (уравнение 1), где V представляет полученные значения АСТ, ЛДГ, СОД, МДА, МПО и NO в контрольной группе, группе, получившей только Кон А, или группе, получившей Лаеннек, соответственно.

Ноябрь 2008 (1)

Анализ днка с помощью гель-электрофореза.

Печень мышей удаляли и гомогенизировали с помощью лизисного буферного раствора (50 мг/мл протеиназы К в 1мМ ЭДТА, 100 мМТрис-HCl с рН 8,0 и 1% додецилсульфат натрия (SDS) ). После инкубирования в течение 2 ч при температуре 50 ^оС (или 37 ^оС в течение ночи) собирали лизат ткани, а надосадочную жидкость получали с помощью смеси гидроксибензола/хлороформа/изоамилового спирта (25:24:1). ДНК осаждалась обезвоженным спиртом и натрия ацетатом, затем ее растворяли в ТЕ-буфере (1мМ ЭДТА, 100 мМТрис-HCl с рН 8,0). Электрофорез проводили в 1,5% агаровом геле (содержащем 0,5 мг/мл этидия бромида) в течение 1 ч, а полосы визуализировали и фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Двухэтапная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (от-пцр)

Общую РНК гепатоцитов крыс экстрагировали с помощью реактива TRIzol (Инвитроджен, Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательность праймеров для крыс выглядит следующим образом: ICAM-1 (прямая): 5' CAGCAGACCACTGTGCTTTGA3', (обратная): 5'GTCGAGCTTCAGGACCCTAGT3'; и b-актин (прямая): 5' ATTGAACACGGCATTGTCAC3', (обратная): 5' CATCGGAACCGATCATTG3'. Последовательность праймеров для мышей выглядит следующим образом: (обратная) 5'CGC- CGGGCTGGGGATGACTTCT3' и (прямая) 5'CACTT- GTGGCCCAGGTATGC3' для bcl-2, и (обратная) 5'GAG- CAGCCGCCCCAGGATG3' и (прямая) 5'GGTGAGC- GAGGCGGTGAGGAC3' для bax, (обраная) 5'GGGCACA- GTGTGGGTGAC3' и (прямая) 5' CTGGCACCACAC- CTTCTAC3' для b-актина. Двухэтапную ОТ-ПЦР проводили в соответствии с инструкцией к аналитическому набору (Такара, Далянь, Китай) и усиливали с помощью системы GeneAmp PCR (Текне TC512, Великобритания). Образцы РНК сначала обратно транскрибировали, а затем сразу же усиливали с помощью ПЦР. Программу Quantity One (версия 4.40) (производство Байо-Рад, США) использовали для анализа значения оптической плотности полос электрофореза. Чтобы исключить разброс значений по количеству и качеству РНК, данные о мРНК каспазы-3 и ICAM-1 корректировали с учетом экспрессии бета-актина (ОП мРНК каспазы-3 или ICAM-1 в сравнении с ОП мРНК бета-актина).

Иммуногистохимический анализ

Иммуногистохимическое окрашивание для ICAM-1 проводили in situ в 24-ячейковом планшете, покрытом коллагеном с помощью комплекса стрептадивин-биотин-пероксидаза. После удаления среды в различные моменты времени клетки фиксировали в 70% спирте и обрабатывали 0,3% раствором Н2О2-метанола и 3% обычной козьей сывороткой, соответственно. Затем клетки инкубировали в течение всей ночи при температуре 4^оС с анти-крысиным антителом к каспазе-3 и ICAM-1 в разведении 1:500, а затем проводили инкубацию в биотинилированном козьем анти-кроличьем иммуноглобулине, а затем в комплексе стрептавидин-биотин-пероксидаза по 20 минут при температуре 37^оС. 3,3-диаминобензидин-Н2О2 использовали для формирование цвета, а контрастное окрашивание клеток проводили с помощью гематоксилина и визуализировали с помощью инвертированного оптического микроскопа (Никон Имаджинг Сейлс Ко Лтд, Китай). Клетки, окрашенные в коричневый цвет, считались положительным результатом, а зеленый уровень сканировали с помощью программы SimplePCI 6.2 (Ки Бонд Инт. Лтд, Гонконг, Китай).

Статистический анализ

Все данные представлены в виде среднего± стандартная ошибка средней (in vivo) и среднего±СО (in vivo) и анализировали с помощью дисперсионного анализа с использованием критерия Стьюдента (односторонний критерий). Статический анализ проводили с помощью программы SPSS 11.5 (SPSS, Чикаго, США). Различие в Р<0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние препарата Лаеннек на активность цитозольных ферментов у мышей, получивших Кон А in vivo.

После внутримышечного введения препарата Лаеннек мышам, получившим Кон А, активность цитозольных ферментов печени аланин аминотрансферазы (АЛТ) и ЛДГ в сыворотке крови снизилась на 48,96% и 65,73%, соответственно (Рис.1).

Обозначения

ALT	АЛТ
LDH	ЛДГ
IU/l	ME/л
Control	Контрольная группа
Con A	Кон А
Con A+Laennec	Кон А + Лаеннек

Рисунок 1. Влияние препарата Лаеннек на уровень АЛТ (А) и ЛДГ (В) в сыворотке крови у мышей линии BALB/c

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05, **p<0,01 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее восьми повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Влияние препарата Лаеннек на активность просачивания биохимических маркеров in vitro.

Чтобы определить, помогает ли препарат Лаеннек при повреждениях печени, вызванных взаимодействием гепатоцитов и лимфоцитов (модель in vitro), также определяли изменения в просачивании цитозольных ферментов печени. Сам по себе Кон А не вызывает цитотоксичности в концентрации 20 мг/мл. Отмечается значительное повышение АСТ (рис. 2А) и ЛДГ (Рис. 2В), вызванное совместным культивированием, по сравнению с группой мышей, не получившей лечение или с группой, получившей только препарат Кон А (20 мг/мл). Препарат Лаеннек снижал уровень АСТ и ЛДГ на 44,93 и 44,53% соответственно.

Обозначения

ALT	АЛТ
LDH	ЛДГ
IU/l	ME/л

Рисунок 2. Влияние препарата Лаеннек на цитотоксичность, индуцированную взаимодействием гепатоцитов, обработанных Кон А и активированных аутологичных лимфоцитов.

Модель in vitroсоздали путем совместной культивации гепатоцитов, обработанных препаратом Кон А (20 мг/мл), и лимфоцитов, стимулированных препаратом Кон А (20 мг/мл). Клетки инкубировали соместно в течение 8 ч, а затем определяли уровень АСТ (А) и ЛДГ (В) в надосадочной жидкости. Гепатоциты предварительно обработали препаратом Лаеннек (1 мл/мл) в течение 1 ч до введения препарата Кон А. Через 24 ч гепатоциты снова промывали до проведения реакции взаимодействия в присутствии того же исследуемого соединения. Холостая группа (□); контрольная группа: гепатоциты обрабатывали только препаратом Кон А(20 мг/мл) (ED); исследуемая группа (□); группа, получавшая Лаеннек. H+ - гепатоциты, стимулированные препаратом Кон А; H – гепатоциты, не подвергшиеся обработке; L+ - лимфоциты, активированные препаратом Кон А. ##p<0.01, ###p<0.001 в сравнении с холостой и контрольной группой; *p<0.05, **p<0.01 в сравнении с исследуемой группой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего .