1 Цель работы
Научиться выявлять отдельные компоненты клетки грибов методами дифференциального окрашивания.
2 Приборы и материалы
Микроскоп,
иммерсионное масло,
фильтровальная бумага,
жидкость для удаления иммерсионного масла,
предметные и покровные стёкла,
микробиологические петли и иглы,
пинцеты.
Для окраски клеточной стенки:
20% водный раствор таннина,
Для окраски запасных питательных веществ:
- раствор Люголя,
- судан III,
- 40% формалин,
- метиленовый синий (1:40),
- метиленовый синий по Лёффлеру,
- фуксин Циля,
- 1% серная кислота.
Для окраски ядер:
- акридиновый оранжевый (1:5000),
- нейтральный красный.
Культуры: p.Chaetomium, p.Aspergillus, p.Candida, p. Saccharomyces.
Содержание работы
3.1 Строение клетки грибов
Клетка грибов – это эукариотическая клетка. У высших мицелиальных грибов клетка – это часть гифы от одной септы до другой. У низших грибов клеткой является всё тело. Одноклеточными грибами являются дрожжи. В любом случае клетка грибов состоит из цитоплазмы с пронизывающей её эндоплазматической сетью (ЭС), окружена цитоплазматической мембраной (ЦПМ) и клеточной стенкой, которая есть не у всех грибов. Строение и функции большинства клеточных структур микромицетов (ЦПМ, ЭС, аппарата Гольджи, ядра, митохондрий, рибосом) являются типичными для эукариотической клетки (рисунок 13).
1 – клеточная стенка; 2 – цитоплазматическая мембрана; 3 – хитосома; 4 – ядро; 5 – ядерная пора; 6 – жировая капля;
7 – элементы эндоплазматической сети; 8 – митохондрия; 9 – элементы аппарата Гольджи; 10 – вакуоль; 11 – гранулы полифосфатов
Рисунок 13 – Строение клетки грибов
Ядро клетки у грибов обычно малых размеров 2-3 мкм в диаметре, но есть ядра до 80 мкм. По форме ядра чаще округлые или вытянутые. У низших грибов клетки многоядерные (более 100 ядер) – мультикарионы. У аскомицетов и дейтеромицетов клетки обычно одноядерны – монокарионы. Клетки базидиомицетов содержат по 2 синхронно делящихся ядра – дикарионы. Для грибов характерна миграция ядер, которая происходит обычно из старых частей мицелия в более молодые. В результате мультикарионы могут встречаться и у высших грибов. Обычно в ядре грибов содержится 8 линейных хромосом, но число их у разных грибов может быть от 3 до 28. Ядерная мембрана двухслойная, связана с ЭС.
Ядрышко – у большинства грибов различимо в интерфазе, при митозе не выявляется. У некоторых зигомицетов оно сохраняется при митозе. Иногда (у некоторых хитридиомицетов, базидиомицетов и дрожжей) образовавшееся в телофазе митоза ядрышко выталкивается в цитоплазму перед окончательным делением ядра. У некоторых грибов ядрышка нет, в зооспорах вместо него присутствует ядерный колпачок, по компонентному составу на 50-70% состоящий из РНК, 30-50% белка, небольшого количества ДНК или представляет собой скопление почти зрелых рибосом.
Клеточный центр у грибов располагается у ядра, часто даже в углублении ядерной мембраны. В клеточном центре центриоли есть не у всех грибов, их нет у некоторых низших грибов и дрожжей.
Вакуоли характерны для грибов так же, как и для растений. Особенно крупные вакуоли, занимающие до 90% объёма клетки, наблюдаются в старой части мицелия, молодые гифы слабо вакуолизированны. В апексе гиф вакуолей нет. В вакуолях, происходящих от ЭС, содержатся запасные питательные вещества, а в вакуолях, образующихся от аппарата Гольджи, находятся выделяемые клеткой вещества.
В качестве резервного источника углерода у грибов обнаружены гликогеноподобные полисахариды и липиды. Гранулы и капли этих запасных веществ откладываются и в цитоплазме, и в вакуолях грибной клетки.
Гранулы полифосфатов (метахроматина) можно обнаружить по всей цитоплазме. Это запас фосфорной кислоты в клетке.
Клеточная стенка есть у большинства грибов. Она выполняет ряд важных функций:
определяет форму клетки;
защищает протопласт от механических воздействий;
осуществляет контакт клетки со средой и другими организмами;
является местом локализации некоторых ферментов;
у некоторых грибов участвует в образовании и распространении спор;
обладает антигенными свойствами.
В последние годы особое значение придаётся химическому составу клеточной стенки. Он зависит от многих факторов, например, меняется при переходе из дрожжевой в мицелиальную стадию роста.
Основу клеточной стенки (80-90%) составляют полисахариды. Минорные компоненты – моносахариды, белки, липиды, полифосфаты, пигменты, кристаллы солей. Содержание пигментов (меланина) может быть очень высоким – до 18% от веса стенки.
Клеточная стенка многослойна (рисунок 14). Наружный слой обычно образован неплотно расположенными молекулами полисахаридов, внутренние слои (их может быть несколько) – плотно и регулярно уложенными полисахаридами. Иногда аморфный слой из неплотно упакованных полисахаридов виден и с внутренней стороны клеточной стенки. Наружный слой клеточной стенки состоит из глюканов. Состав внутренних слоёв различен у разных классов грибов. У большинства грибов внутренние слои состоят из хитин-глюканового комплекса; у зигомицетов – из хитин-хитозанового, у оомицетов – из целлюлозо-глюканового комплекса.
Особый состав характерен для клеточной стенки дрожжей. Это маннано-глюкановый комплекс, из маннана состоит наружный слой стенки, внутренний – из глюкана. Небольшое количество хитина обнаруживают в клеточной стенке дрожжей в местах отделения почки – почечном рубце.
Полисахариды клеточной стенки образуются в ЭС и с помощью мелких вакуолей, отшнуровывающихся от аппарата Гольджи, транспортируются к ЦПМ. Пузырьки, содержащие хитин, называют хитосомами (рисунок 13, 3). Хитосом особенно много в апикальной части гиф, где идёт активное строительство клеточной стенки.
На поверхности клеточной стенки некоторых спор грибов образуются шипы, бородавки, складки. Клеточная стенка многих грибных спор гидрофобна.
Над поверхностью клеточной стенки у дрожжей часто бывает капсула, состоящая из полисахаридов. Состав капсулы видоспецифичен (β-маннаны, фосфоманнаны, гетерополисахариды). Полисахариды капсулы постоянно отделяются и уходят в среду – внеклеточные полисахариды.
Жгутики - органы движения зооспор, планогамет и планозигот низших грибов и слизевиков. У высших грибов подвижных стадий в жизненном цикле нет. Тонкое строение жгутиков грибов типично для эукариотической клетки. Жгутик образован двадцатью микротрубочками, покрытых ЦПМ, при чём девять пар микротрубочек расположены по
окружности, а одна пара – в центре аксонемы жгутика. Формула системы микротрубочек жгутика: 9х2+2.
Жгутики бывают двух типов: гладкий и перистый. По строению они одинаковы, только на перистом жгутике имеются белковые выросты не фибриллярной природы. Хитридиомицеты имеют один гладкий жгутик, оомицеты – два (гладкий и перистый), миксомицеты – два гладких (рисунок 15). Место прикрепления жгутика к клетке может быть разным: спереди – апикально, сбоку – латерально, сзади – терминально.
Тип, число и место прикрепления жгутиков используется для классификации низших грибов.
Для выявления отдельных структур в клетках всех микроорганизмов, в том числе и эукариотических, используют дифференциальные методы окрашивания. Дифференциальные методы окрашивания основаны на способности красителей связываться только с определёнными клеточными компонентами. В отличие от простых методов окрашивания, дифференциальные методы, как правило, более сложны методически.
1 – наружный слой полисахаридов; 2-6 – внутренние слои полисахаридов; 7 – цитоплазматическая мембрана; 8 – септа; 9 – пора септы
Рисунок 14 – Схематическое строение клеточной стенки грибов
1
2
4
5
1 – жгутики хитридиомицетов; 2 – жгутики миксомицетов;
3 – терминальные жгутики оомицетов; 4 – апикальные жгутики оомицетов; 5 – латеральные жгутики оомицетов
Рисунок 15 – Жгутики зооспор низших грибов
3.2 Окрашивание клеточной стенки таннином
Приготовить фиксированный препарат
Окрасить препарат 20% водным раствором таннина в течение 20-30 минут.
Микроскопическая картина: клеточная стенка окрашивается в жёлто-коричневый цвет.
3.3 Окрашивание ядер флуорохромом
Приготовить прижизненный препарат.
Добавить водный раствор акридинового оранжевого (1:5000) и выдержать в течение 10 минут.
Рассмотреть препарат в люминесцентном микроскопе.
Микроскопическая картина: цитоплазма – тёмно-зелёная, ядра – светло-зелёные, метахроматин – ярко-красный, вакуоли – розовые.
3.4 Окрашивание ядер нейтральным красным
Приготовить фиксированный препарат.
Окрасить препарат нейтральным красным в течение 5 минут.
Слить краситель и промыть препарат водой.
Рассмотреть препарат в люминесцентном микроскопе.
Микроскопическая картина: цитоплазма – зелёно-жёлтая, ядра – красные.
3.5 Выявление запасных полисахаридов
Гранулы полисахаридов выявляют при обработке клеток насыщенным раствором Люголя.
Внести культуру гриба в каплю раствора Люголя на предметном стекле.
Добавить каплю 1% НСl.
Накрыть покровным стеклом и микроскопировать.
Гранулы гликогеноподобных полисахаридов окрашиваются в красно-коричневый цвет. Полисахарид может быть распределён в цитоплазме или вакуолях не в виде гранул, а диффузно – в виде коричневатой области.
3.6 Выявление запасных липидов
Окраска запасных липидов в клетках грибов проводится также, как и окраска липидоподобного вещества прокариот - поли-β-оксимасляной кислоты.
3.6.1 Способ 1
Приготовить в воде прижизненный препарат на предметном стекле.
Добавить каплю раствора судана III.
Накрыть покровным стеклом и микроскопировать.
Капли липидов окрашиваются в красно-бурый цвет, цитоплазма остается бесцветной.
3.6.2 Способ 2
1. Приготовить прижизненный препарат в воде на предметном стекле.
2. Добавить каплю 40% формалина и выдержать 5 минут.
Добавить каплю метиленового синего, выдержать 10 минут.
Добавить каплю судана III.
Выдержать 5 минут, накрыть покровным стеклом и микроскопировать.
Капли липидов окрашиваются в розовый или оранжевый цвет, цитоплазма - в синий.
3.6.3 Выявление липидов без окрашивания
Приготовить препарат грибов в воде или в красителе метиленовом синем.
Накрыть покровным стеклом и микроскопировать.
Липиды видны в цитоплазме как сильно преломляющие свет (как бы светящиеся) капли.
3.7 Выявление полифосфатов
Полифосфаты (волютин, метахроматин) как резерв фосфорной кислоты образуются в клетках как прокариот, так и эукариот, и выявляются одинаковыми методами.
3.7.1 Окраска полифосфатов по методу Лёффлера
Метод основан на свойстве метахромазии – способности полифосфатов изменять цвет красителя (метиленового синего) - с синего на красный.
Фиксированный препарат окрасить в течение 5 минут метиленовым синим по Лёффлеру.
Краситель слить, препарат промыть водой, высушить и микроскопировать.
Микроскопическая картина: гранулы полифосфатов окрашены в красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма - в голубой.