Тема 3 Учет ризосферной и корневой микрофлоры растений Цель занятия:

• Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней (по Теппер)

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Метаногенное сообщество

2. Сульфидогенное сообщество

3. Аноксигенное фототрофное сообщество

4. Бактериальный окислительный фильтр и изотрофы

5. Аэробное сообщество

6. Сообщество и филогения

7. Роль микробных сообществ в глобальных изменениях

8. Эволюция микробных сообществ

9. Характеристика водоемов

10. Физико-химические свойства водной массы:

10.1 Температура

10.2 Свет

10.3 Солевой состав

10.4 Активная кислотность среды

11. Донные отложения

Оборудование и материалы:

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Чашки Петри с плотной питательной средой.

5. Микробиологические петли.

6. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями).

Общие сведения

Если в цианобактериальных матах и наземных водорослевых корочках весь бактериальный комплекс сконцентрирован в 1-сантиметровом слое (хотя и разделенном на ярусы), то с появ­лением высших растений произошло пространственное разобще­ние бактерий в связи с их расселением по различным органам растений, иногда значительно удаленным друг от друга. Пос­кольку каждый из органов растений представляет особую эконишу по отношению к поселяющимся там микроорганизмам, были предложены термины, определяющие эти ниши. Филлосфера - надземные части растений, ризосфера - подземные, геммисфера - почки растений, спермосфера - семена. Впоследствии для более четкого отделения поверхности листьев и корней от зон, прилегающим к ним, появились термины "филлоплана" и "ризоплана" - под которым подразумевают только то, что находится непосредственно на поверхности корня и прикреп­лено к корню. Бактерии обнаруживаются также на цветах, ягодах, пло­дах и даже в сокотечении растений.

Освоение бактериями экониш, связанных с прижизненными выделениями растения, происходило не только путем поселения микроорганизмов на поверхности различных органов растений (эпифитное сообщество), но и путем внедрения их в ткани расте­ний (эндофитное сообщество). В результате сформировались как взаимополезные для растений и микроорганизмов симбиотические связи, так и неблагоприятные для растений антагони­стические связи, связанные с появлением фитопатогенов. Все микробиологические исследования ризосферы и филлосферы, начатые более полувека назад, связаны большей частью с при­кладными аспектами микробиологии. Это поиск микроорганиз­мов - стимуляторов роста сельскохозяйственных растений, раз­работка биологических основ борьбы с фитопатогенами, изуче­ние влияния почвенных условий на микробные сообщества и рост растений. В результате в качестве объектов исследования выбирались, главным образом, разнообразные культурные рас­тения.

Ход работы

Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней (по Теппер)

Из выкопанного монолита почвы с растениями стерильными пинцетом и ножницами отбирают 1 г молодых корней при­мерно одного диаметра с приставшими к ним частицами поч­вы.

Корни помещают в 1-ю колбу со 100 мл стерильной во­допроводной воды и взбалтывают 2 мин. Стерильным пинцетом, корни извлекают и переносят последовательно во 2-ю, 3-ю и т. д. до 6-й пробирки, содержащие по 9 мл стерильной водопро­водной воды. В каждой пробирке корни отмывают по 2 мин.

Из каждой пробирки отдельно стерильной пипеткой берут 0,1 мл отмывной воды, наносят на поверхность питательной пластины (МПА) и отдельным шпателем Дригальского, держа полуоткрытую чашку около пламени горелки, растирают. Чашки помещают в термостат при 28—30 °С, спустя 3—5 сут чашки анализируют.

По мере отмывания корней численность бактерий не убывает, а в ряде случаев — даже увеличивается. Это свиде­тельствует о тесной связи эпифитных микроорганизмов с тка­нями растений, для которых они служат естественным защит­ным барьером. В чашках с посевом из первых отмываний мно­го крупных колоний спороносных форм бактерий — это могут быть и почвенные обитатели. По мере отмывания количество колоний бациллярных форм уменьшается и возрастает число мелкоточечных колоний неспорообразующих форм рода Pseudomonas.

I. Для определения количества микроорганизмов в ризосфере и на корнях суспензию из 1-й колбы (1-го отмывания) допол­нительно взбалтывают 5 мин. Затем из нее готовят разведения, из которых делают поверхностные посевы. Посев производят из 4-го, 5-го и 6-го разведений. Для подсчета клеток в 1 г абсолютно сухой почвы ризо­сферы число колоний на чашке умножают на 10 (чтобы опре­делить их число в 1 мл) и на степень разведения, а затем делят на массу абсолютно сухой почвы ризосферы.

II. При определении количества микроорганизмов на 1 г кор­ней число колоний, выросших в чашке, умножают на 10 (чтобы опре­делить их число в 1 мл), на степень разведения и делят на величину массы сырых корней.

III. Исследование морфологии колоний. По истечению 3-5 суток на чашках анализируют различные 3-5 колонии по следующей схеме:

- величина колонии – точечные (D – меньше 1 мм), мелкие (D – 1-2 мм), средние (D – 2-4 мм), и крупные (D – 4-6 мм и более).

- форма колонии - округлая, амебовидная, ризоидная.

- оптические свойства – прозрачная, матовая, флуоресцирующая, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая.

- цвет – отмечают цвет колонии и выделение пигмента в среду.

- поверхность – гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая.

- профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, врастающий в агар и т. д.

- край колонии – ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и т. д.

- консистенция – маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая.

При описании края и структуры колонии чашки Петри, не открывая, помещают под микроскоп дном вверх.

IV. Исследование морфологии микроорганизмов. Морфологию бактерий изучают из отдельной колонии (выбранных и проанализированный по схеме приведенной выше). Окрашивание производят по Граму. Окрашенный препарат микроскопируют, пользуясь объективами 40 и 90. Просматривая препараты, делают зарисовки микроорганизмов, обращая внимание на форму, взаимное положение клеток и на соотношение размеров бактерий при разном увеличении микроскопа; определяют отношение к окраске по Граму. Подсчитывают количество колоний на чашке.

Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1. Описать последовательность проведения работ

2. Результаты работы записать.

3. Изложить выводы по работе.