Общие сведения

Вводные пояснения. Аммонификация — это минерализация азотсодержащих органических веществ, протекающая под воздействием аммонифицирующих микробов. Микроорганизмы, осуществляющие аммонификацию бел­ковых веществ, выделяют в окружающую среду протеолитические ферменты (протеазы и пептидазы), под действием кото­рых белки гидролизуются до аминокислот. В свою очередь, аминокислоты, поступая в клетку, дезаминируются с образова­нием аммиака (NH₃), органических кислот и других продук­тов. В белках С : N = 3,5 : 1. При разложении белков в анаэробных условиях выделяются также H₂S, меркаптаны, скатол и индол, имеющие неприятный запах, кадаверин и путресцин (диамины). В аэробных условиях конечными про­дуктами являются NH₃, CO₂, Н₂О, сульфаты.

Благодаря аммонификации представителей растительного и животного мира и их продуктов жизнедеятельности (мочевины, испражнений) почва обогащается азотом и другими соединениями. Одновременно с этим аммонифицирующие микробы выполняют огромную санитарную роль, очищая почву и гидросферу от разлагающегося органического субстрата. Основными представителями широко распространенных в природе аммонифицирующих микробов являются следующие микроорганизмы: Вас. probatus и Sporosarcina ureae.

Спорообразующие аэробы — это Вас. mesentericus (картофельная бактерия), Вас. megatherium (капустная бактерия), Вас. subtilis (сенная палочка), Вас. mycoides (грибовидная бацилла). Не образующие спор аэробные аммонификаторы — это Е. coli, Proteus vulgaris, Ps. fluorescens.

К анаэробным спорообразующим аммонификаторам относятся Cl. putrificum (газообразующая клостридия), Cl. sporogenes. Подсчитано, что весь животный мир земного шара за сутки выделяет 150 тыс. т мочевины. За год это составляет более 50 млн. т мочевины, или 20 млн. т азота.

Аммонификацию вызывают также актиномицеты, грибы, триходермы, живущие в почве.

Нитрификация — следующий за аммонификацией этап превращения азота микроорганизмами. Этот процесс представляет собой окисление аммиака, образующегося при разложении органических азотсодержащих соединений.

Денитрификация, протекающая под воздействием микробов, представляет собой восстановление нитратов с образованием в качестве конечного продукта — молекулярного азота, возвращающегося из почвы в атмосферу. Вызывается этот процесс денитрифицирующими бактериями. Наиболее распространенные из них в природе: Tiolacillus denitrificans — палочка, не образующая спор, факультативный анаэроб; Ps. fluorescens — подвижная палочка, выделяет зеленоватый пигмент, быстро разлагает нитраты; Ps. aeruginosa — бактерия сходна с предыдущей; Ps. Stutzeri — небольшая палочка, образующая цепочки, разлагает нитраты в анаэробных условиях.

Ход работы

Минерализация азотсодержащих органических соединений

Аммонификация белковых веществ

Постановка опыта. Для изучения аммонификации белко­вых веществ питательной средой может служить мясной буль­он с добавлением 3% пептона.

По 10 мл среды разливают в 2 пробирки и добавляют по 1.0 -2.0 г почвы. Пробирки закры­вают ватными пробками. Над средой подвешивают две бумажки — красную лакмусовую, или универсальную индика­торную бумагу, смоченную дистиллированной водой, для об­наружения выделяющегося аммиака и фильтровальную, смо­ченную щелочным раствором ацетата свинца, для выявления сероводорода и меркаптана. Закрепляют их между пробкой и стенками пробирки. Бумажки не должны касаться среды.

На 3—5-е сут инкубации при 28—30 °С опыт заканчивают и содержимое пробирок анализируют. Определяют возбудите­лей процесса аммонификации белка и продукты их жизнеде­ятельности.

Микроскопирование. Для обнаружения возбудителей гнилостного распада белковых веществ готовят фиксированный и окрашенный препарат.

Чаще других на препарате встре­чаются подвижные клетки Proteus vulgaris (от греч. Proteys — в древнегреческой мифологии морское божество, способ­ное менять свой облик; от лат. vulgaris — обыкновенный, простой) пре­обладающие на первых стадиях распада белков.

Р ис.1. Proteus vulgaris

Это неспорообразующие, неоди­наковой длины палочки. Кроме того, на препарате можно наблюдать много спорообразующих кле­ток Bacillus mycoides и Clostridium putrificus. У последних споры распо­ложены терминально и диаметр их превышает ширину клетки. Вас. mycoides вызывает аммонификацию белковых ве­ществ в аэробных условиях, а С. putrificus — в анаэробных, но может также развиваться и в аэробных условиях, если в среде находятся аэробные микроорганизмы, поглощающие кислород.

Качественные реакции на продукты гнилостного распада белка. Выделяющийся в атмосферу NH₃ окрашивает подве­шенную полоску красной лакмусовой бумаги в синий цвет.

Накопление аммиака в культуральной жидкости устанав­ливают при помощи реактива Несслера. Реакция капельная. На фарфоровые пластинки с лунками или в чашки помещают каплю культуральной жидкости, затем — каплю реактива. При большом количестве аммиака образуется коричневый или бу­роватый осадок, при небольшом — появляется оранжевая или желтая окраска.

Сероводород обнаруживают с помощью подвешенной по­лоски фильтровальной бумаги, смоченной ацетатом свинца [РЬ(СН₃СОО)₂]. Бумага чернеет под действием сероводорода. Если она покрывается серебристым налетом, значит, наряду с H₂S выделяются еще и меркаптаны (например, метилмеркаптан CH₃SH).

Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1. Описать последовательность проведения работ

2. Результаты работы записать.

3. Изложить выводы по работе.

ТЕМА 6

ИЗУЧЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ ПОЧВЫ

Цель занятия:

• Выделение углеводородокисляющей микрофлоры почвы

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Симбиозы прокариот и протистов

2. Симбиоз микроорганизмов и растительноядных животных

3. Симбиозы микроорганизмов и морских животных

4. Паразитизм – как стратегия жизни микроорганизмов

5. Факторы патогенности

6. Роль токсинов в экологии бактерий

7. Концепция и стратегии паразитизма

Оборудование и материалы

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Пробирки с жидкой питательной средой..

5. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями).

Общие сведения

Широкая механизация сельского хо­зяйства приводит к загрязнению сельскохозяйственных земель значительным количеством углеводородов. Так, керосин и бензин, используемые в тракторных, автомобильных и дру­гих двигателях, мазут и дизельное топливо, применяемые на сельских электростанциях, попадая в почву, приводят к нару­шению ее свойств, ухудшают экологическую ситуацию, а ава­рийные разливы нефти превращают почву в техногенную пус­тыню. Образцы почвы, загрязненные нефтепродуктами, продемонстрировали мутагенные эффекты на растениях. В городе источниками загрязнения являются сети АЗС, моек, станций технического обслуживания автомобилей содержание нефтепродуктов в почвах "значительно увеличилось". Доля участков, загрязненных нефтепродуктами свыше допустимого уровня, в среднем по Москве составила 26%, бензофенолом - 34% от общего числа обследованных участков.

Состав нефти и нефтепродуктов характеризуется высо­ким процентом парафиновых, нафтеновых и ароматических углеводородов, В почве эти продукты окисляют микроорга­низмы. Углеводороды хорошо окисляют представители родов Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida), Mycobacterium, Arthrobacter и Nocardia. Загрязненные места должны быть рано или поздно подвергнуты очистке — ремедиации (ле­чению). Внесение в загрязненные почвы микроорганизмов, способных разлагать соответствующие специфические вещества используют в целях очистки загрязненных почв органическими веществами и нефтепродуктами. В настоящему времени выделено и описано большое количество бактерий, способных использовать нефтяные загрязнения, токсические соединения. Применение таких культур в качестве посевного материала может быть полезно в свежих загрязнениях, когда ав­тохтонная микробная популяция еще не успела развиться или плотность ее очень низка. В любом случае необходимо обеспечить доступность загрязняющих веществ для использования их микро­организмами. Здесь важную роль играют дисперсия и растворение загрязнителей, а также снабжение микроорганизмов источника­ми азота и фосфора. Их недостаток лимитирует микробный мета­болизм и рост, а это, в свою очередь, ограничивает процесс био­деградации.