Ход работы
Метод теплой трипсинизации используют для диспергирования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:
а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 — 5 мм, ткань многократно (3—4 раза) промывают физиологического раствора до полного освобождения от эритроцитов;
б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добавляют 0,25%-ный раствор трипсина, в которой перемешивают ткань 10 — 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают, а к ткани добавляют, свежую порцию 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 1:10-20. Температура раствора может варьировать от комнатной до 37С.. Дезагрегацию ткани ферментом повторяют 2-3 раза;
в) последнюю экстракцию сливают в пенициллиновый флакон, клетки осаждают в течение 10-15мин;
г) осадок клеток собирают (с помощью пипетки) со дна флакона стараясь не захватывать крупные агрегаты ткани и определяют концентрацию клеток в суспензии.
Значительно реже для дезагрегации клеток используют механический способ.
Определение концентрации клеток. Для приготовления посевной концентрации клеток необходимо вначале определить их концентрацию в исходной суспензии. Подсчет клеток производят в счетных камерах различных систем (Горяева, Спенсера, Бюркера, Тома, Фукс-Розенталя и др.). Для подсчета отбирают пробу после тщательного перемешивания суспензии клеток. Для дифференциации живых и мертвых клеток используют витальные красители: метиленовую синь или нейтральный красный. Подсчитывают количество живых клеток в 3 — 4 камерах (увеличение микроскопа: окуляр 7, объектив 20 по всей площади камеры, четырехкратно, каждый раз, заряжая камеру вновь, причем, во внимание берутся только те клетки, которые расположены в камере, в границах, очерченных сеткой – 225 больших квадратов), определяют среднее значение и рассчитывают концентрацию клеток в 1 мл по формуле, соответствующей данной системе камеры, например для камеры Горяева:
где 100- количество кубических миллиметров в 1 cм; а - количество клеток в камере; н - разведение клеточной суспензия; 0,9 - объем камеры Горяева в мм3
При использовании счетных камер других их систем в лааной формуле необходимо заменить знаменатель - объем камеры.
Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе
1. Описать последовательность проведения работ
2. Результаты работы записать.
3. Изложить выводы по работе.
ТЕМА 5
МИНЕРАЛИЗАЦИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ. АММОНИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Цель занятия:
Изучения аммонификации микроорганизмами белковых веществ питательной среды
Вопросы и задания для самоподготовки
1. Почва – как продукт метаболизма биосферы
2. Почва – гетерогенная среда обитания микроорганизмов
3. Функциональная роль почвенных микроорганизмов
4. Почва – гетерохронная среда обитания микроорганизмов
5. Экологические типы микроорганизмов
6. Микроорганизмы аэробной зоны
7. Микроорганизмы микроаэрофильной зоны
8. Микроорганизмы анаэробной зоны
Оборудование и материалы:
Микроскоп биологический МБ-3 или аналогичный
Спиртовка.
Термостат.
Пробирки питательной средой (МПБ + 3% пептона).
Микробиологические петли.
Почва.
Полоски красной лакмусовой и фильтровальной бумаги, раствор ацетата свинца.
Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями).
Белые фарфоровые пластинки с лунками (или фарфоровые чашки).
Реактив Несслера