Типы микроскопов и принципы микроскопии; правила работы с микроскопом при использовании иммерсионной системы

Микроскопический метод исследования - это изучение под микроскопом окрашенных препаратов из исследуемого материала:

Достоинства микроскопического метода исследования:

- быстрый;

- ранний.

Недостатки:

- неточный (ориентировочный)

основание

тубусодержатель

тубус с револьвером для объективов

предметный столик

макровинт

микровинт

Вкл/выкл

Настройка света

Конденсор и светофильтры

Винты для регулирования предметного столика

окуляр

штатив

Световой микроскоп состоит из частей:

механической оптической

предназначена для устойчивости предназначена для освещения и увеличения

прибора, удобства пользования: объектов:

- подставка (ножка) Осветительный аппарат

- тубусодержатель находится под предметным столиком

- тубус - зеркало плосковогнутое (при искус-

- револьвер ственном освещении используется

- предметный столик вогнутая сторона зеркала)

- макровинт - диафрагма (регулирует объем

- микровинт светового пучка)

- конденсор (в фокусе конденсора

собираются параллельные лучи света)

Для увеличения:

- объективы:

малый 8

большой 40

иммерсионный 90

- окуляры:

7, 10, 15 раз

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра.

Разрешающая способность микроскопа определяется размером наименьшего объекта, который можно увидеть в данный микроскоп. Для световых микроскопов разрешающая способность – 0,2 мкм, для электронного - в 100-1000 раз выше (0,1 – 0,2 мкм).

Системы микроскопии

сухая иммерсионная

- между объектом и объективом - между объектом и объективом -

находится воздух; жидкость (масло, вода);

- используется для изучения крупных - используется для изучения

биологических объектов (ботанических, микроорганизмов;

гистологических);

- максимальное увеличение объектива 40 - увеличение объектива 90;

- создает недостаточную освещенность, - достигается лучшая освещенность,

т.к. луч света проходит через неоднород- т.к. иммерсионное масло и стекло

ную среду: стекло-воздух, коэффициен- имеют почти одинаковый

ты преломления лучей света которых коэффициент преломления лучей

соответствуют 1,52 и 1,0, в результате света (1,515 и 1,52), что создает

чего происходит преломление и однородную среду, и рассеивания

отклонение лучей света. лучей света не происходит.

Y Y

линза n=1,52 линза B n=1,52

воздух C n=1,0 масло C n=1,515

B

стекло n=1,52 стекло n=1,52

C C

B B

Преимущества иммерсионной системы

1. Большее увеличение (увеличивает в 90 раз вместо 40 в сухой системе микроскопии)

2. Лучшая освещенность за счет создания однородной среды для прохождения лучей света с помощью иммерсионного масла

- Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом микроскопе. Фазово-контрастная микроскопия основана на явлении интерференции света, прошедшего и не прошедшего через объект, и позволяет наблюдать прозрачные объекты, отличающие­ся от окружающей среды (или других структур клетки) по показателю преломления или по толщине и вызывающие изменение фазы прошедшего через них света. Благодаря специ­альному приспособлению в объективе (фазовая пластинка) и в конденсоре (кольцевая диафрагма) эти объекты выглядят более темными (позитивный фазовый контраст) или более светлыми (негативный фазовый контраст) по сравнению с окружающей средой. Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т.п.

- Темнопольная микроскопия (ультрамикроскопия) основана на явлении светорас­сеивания. При темнопольной микроскопии в объектив попадают только лучи, рассеянные объектом, и не попадают прямые лучи от осветителя. Поэтому наблюдаемые микроорга­низмы кажутся ярко светящимися на темном фоне. Темнопольную микроскопию применяют для прижизненного изучения лептоспир, спиро­хет, а также микроорганизмов слишком мелких, чтобы их можно было различить при обычном светлопольном освещении. С помощью этого типа микроскопии изучают препараты типа «раздавленная капля». Для темнопольной микроскопии используют обыч­ные объективы и специальные темнопольные конденсоры.

- Люминесцентная микроскопия основана на использовании явления флюоресцен­ции. Применяют специальные люминесцентные микроскопы или приспособления к обыч­ным микроскопам. Так как большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, то их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разве­денными растворами специальных красителей (флюорохромы), которые связываются с определенными структурами клетки. Люминесцентная микроскопия применяется также для цитохимического изучения живых и фиксированных микроорганизмов, включений в клетках, образуемых вирусами. Флюорохромы избирательно связываются с полимерами клеток (акридиновый оранжевый, связываясь с ДНК, флюоресцирует зеленым, а с РНК – красным цветом).

Люминесцентную микроскопию применяют также для выявления антигенов и антител. С этой целью используют метод иммунофлюоресценции (люминесцентно-серологический метод). Этот метод позволяет выявить в препарате микробы, содержащие определенные антигены. Для их обнаружения необходимо иметь антисыворотки, содержащие антитела к этим антигенам (к антисывороткам химическим путем присоединены молекулы флюорохромов - люминесцирующие сыворотки). На фиксированный препарат во влажной камере наносят люминесцирующую сыворотку, инкубируют, промывают раствором хлорида натрия, высушивают и рассматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате есть микробы, содержащие антиген, антитела к которому были в люминесцирующей сыворотке, они ярко светятся. Остальные микробы не люминесцируют.

- Электронная микроскопия. Изображение в электронном микроскопе образуется не с помощью световых лучей и стеклянных линз, а с помощью потока электронов, который фокусируется электрическим или магнитным полем. Разрешающая способность примерно в 2000 раз больше, чем светового (и составляет 0,15 нм), и с его помощью можно увидеть даже крупные молеку­лы. Объекты при электронной микроскопии находятся в глубоком вакууме, поэтому подвергаются фиксации и специальной обработке. Кроме того, они должны быть очень тонкими, т.к. поток электронов сильно поглощается объектом (используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, помещенные на тончайшие пленки). Применение электронного микроскопа значительно расширило знания о вирусах, фагах и других микроорганизмах. Наиболее широко применяется просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия. Просвечивающая применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, строения мелких объектов (вирусов, жгутиков, мембран). Сканирующая применяется для изучения поверхности объектов.

к работе № 3

Классификация микроорганизмов

Надцарства Прокариоты Эукариоты

(клеточные, доядерные) (клеточные, ядерные)

Царства Вирусы Бактерии Грибы Простейшие

(доклеточные, доядерные)

риккетсии актиномицеты спирохеты

хламидии