3 Трансфекция

Частным случаем трансформации является трансфекция. Данное явление впервые было описано в 1964 году на примере ВасШш зиЫШз. Его сущность заключается в продуктивной инфекции бактерий данного вида ДНК, выделенной из лизирующих их фагов.

Как и в случае классической трансформации, чувствительными к трансфекции являются лишь те клетки, которые компетентны к восприятию трансформирующей ДНК.

Явление трансфекции также установлено при обработке клеток кишечной палочки ДНК, выделенной из разных кишечных фагов, а также в случае инфицирования растений табака инфекционной РНК, выделенной из вируса мозаичной болезни табака. Ряду исследователей удалось наблюдать формирование вируса оспы после инфицирования компетентных клеток млекопитающих ДНК, выделенной из оспенного вируса.

Механизм трансфекции зависит от рекомбинационной системы клеток-реципиентов и рекомбинационный механизм трансфекции отличается от рекомбинационного механизма трансформации. В частности, трансфекция

31

ВасШиз зиЫШз ДНК из фага Н1 требует объединения 4-5 молекул фаговой ДНК. Механизм компетентности клеток к трансформации и трансфекции одинаковый.

ЛЕКЦИЯ5

5. Механизмы гибридизации бактерий (трансдукция)

Вопросы

1 Общая характеристика явления

2 Общая (неспецифическая ) трансдукция

3 Специфическая (ограниченная ) трансдукция

4 Абортивная трансдукция

1 Общая характеристика явления

Трансдукция- перенос фрагментов хромосомы (ДНК) от одних бактериальных клеток другим с помощью бактериофагов. Открытие трансдукции состоялось в 1951 году и принадлежит Ледербергу. Этот феномен обнаружен у кишечной палочки, дизентерийных бактерий, сальмонелл, псевдомонад, вибрионов, стафилококков и многих других бактерий. Трансдукции подвержены гены, контролирующие самые разные свойства бактерий.

За трансдукцию ответственны умеренные фаги, анормальные по своей функции, т.е. потерявшие способность лизогенизировать трансдуцируемые бактериальные клетки. Фаговая ДНК в белковой оболочке трансду-цирующего фага замещена переносимым генетическим фрагментом ДНК бактерии-донора.

Охарактеризованы два основных типа трандукции, осуществляемой с помощью бактериофагов - общая и специфическая.

2 Общая (неспецифическая ) трансдукция

При общей трансдукции фаговые частицы, содержащие сегменты ДНК клетки-хозяина, переносят относительно протяженные участки геномной ДНК от одной бактериальной клетки к другой. Трансдуцирующие фаговые частицы образуются в ходе определенных инфекционных процессов, когда ДНК клетки эффективно деградирует и фрагменты

32

клеточной ДНК, по размеру примерно соответствующие фаговому геному, случайно упаковываются в зрелые частицы бактериофага. В результате последующего инфицирования клеток бактерий популяцией фаговых частиц, содержащих в том числе и трандуцирующие фаги, с помощью последних происходит передача ДНК донорных клеток этим инфицируемым клеткам. Рекомбинация между введенными фрагментами донорной ДНК и ДНК клетки-реципиента приводит к изменению генотипа последней.

Каждая трансдуцирующая фаговая частица обычно содержит только один случайный фрагмент исходной донорной хромосомы. Вероятность включения в такую частицу любой части донорного генома примерно одинакова. Однако благодаря довольно большому размеру трансдуцируемых сегментов ДНК (для определенных бактериофагов он составляет около 100 т.п.н., или 2,5 процента всей хромосомы кишечной палочки) обычно реципиентная клетка приобретает за один акт трансдукции целую группу генов. В результате гены, тесно сцепленные друг с другом в хромосоме донора, с высокой частотой котрансдуцируются, тогда как гены, удаленные друг от друга, транс дуцируются независимо. Определение частоты котрансдукции генов помогает уточнить генетические карты, позволяя оценивать относительные расстояния между тесно сцепленными генами. 3 Специфическая ( ограниченная ) трансдукция

Трансдукция второго типа, специфическая, свойственна умеренным бактериофагам, инфекционный цикл которых прерывается в результате включения генома вируса в специфический хромосомный локус ДНК инфицированной клетки. Бактерии, содержащие такие интегрированные фаговые геномы, получили название лизогенных. Они несут вирусные геномы как наследственные элементы собственных хромосом. В лизогенной клетке вирусные и клеточные геномы реплицируются как единое целое и являются взаимно совместимыми. Интеграция фагового генома с геномом клетки-хозяина лишает фаг возможности вызывать гибель клетки и продуцировать инфекционное потомство. По этой причине бактериофаг,

33

способный лизогенезировать, в отличие от вирулентного фага, получил название умеренного.

При определенных условиях - индукции - лизогенное состояние прерывается и вирусный геном вырезается из хромосомы ютетки-хозяина. Он реплицируется, образуя множество вирусных частиц, и убивает клетку. Обычно вырезание вирусного генома происходит очень точно и образующийся фаг содержит вирусный геном, полностью соответствующий исходному.

Иногда фаговый геном вырезается неправильно и в дочерние фаговые частицы включаются хромосомные гены, прилегающие к интегрированному вирусному геному. Эти гены включаются вместо некоторых вирусных генов. Во время следующего цикла инфекции гены клетки-донора переходят вместе с фаговыми генами в реципиентные клетки. После включения ДНК трансдуцирующего фага в геном реципиента клетка приобретает наряду с фаговым геномом генетическую информацию предыдущего хозяина фага.

Таким образом, при специфической трансдукции фаг служит вектором для переноса генов от одной клетки в другую. С помощью этого механизма трансдуцируются только те хромосомные гены клетки-хозяина, которые тесно сцеплены с сайтом интеграции вирусного генома.

Поскольку различные умеренные фаги встраиваются в разные хромосомные сайты, при их неправильном вырезании образуются фаги, которые трансдуцируют разные хромосомные гены. Так фаги лямбда трансдуцируют гены, ответственные за метаболизм галактозы, или гены, контролирующие синтез биотина, а фаги ф80 - различное число генов, кодирующих ферменты биосинтеза триптофана.

Фаговый геном способен к специфической трансдукции при условии :

1 Он должен приобрести ковалентно сцепленный сегмент невирусной ДНК, который будет трансдуцироваться. Этот сегмент ДНК обычно имеет клеточное происхождение, но в принципе он может быть из любого источника. Он может включаться в любое место вирусного генома, если это

34

не влияет на репликацию вирусной ДНК в инфицированной клетке хозяина или на её способность упаковываться в зрелые фаговые частицы.

2 Фаговый геном должен быть способен реплицироваться после того, как произошло инфицирование реципиентной клетки, т.е. в вирусной ДНК должны сохраняться область начала репликации (оп) и гены, необходимые для осуществления репликации.

3 Фаговые гены, кодирующие структурные фаговые белки, должны быть функционально активными.

Специфическая трансдукция широко используется в молекулярной генетике. Рассмотрим один из примеров такого применения данного явления. Ген кишечной палочки, кодирующий синтез фермента бета-галактозидазы, содержит 3600 п.н. и составляет одну тысячную генома данного микроорганизма. Если фрагмент ДНК бактериальной клетки, кодирующий синтез бета-галактозидазы, встраивается в геном трансдуцирующего бакте­риофага лямбда, он занимает там одну пятнадцатую часть, то есть ДНК фага лямбда обогащена бета-галактозидазным геном в 100 раз больше, чем ДНК кишечной палочки.

Это упрощает выделение бета-галактозидазного гена и позволяет идентифицировать его регуляторные участки и определить их нуклеотидную последовательность. Подобным же образом с получением трандуцирующих фагов ф80 удалось выделить и охарактеризовать гены, которые образуют триптофановый оперон.