1.5. Комплексообразование hedp с ионами щелочных металлов

Молекула HEDP содержит в своем составе семь электронодонорных атомов кислорода, которые могут образовывать координационные связи с ионами металлов вплоть до сильно кислых сред [17, 18].

Особенностью HEDP является образование довольно устойчивых комплексов с щелочными катионами при рН > 7. Известны комплексонаты состава MH₂L^- , MHL^2- и M₂HL^-.

Исходя из данных работы [19] применение в качестве «фоновых» электролитов солей щелочных катионов при изучении комплексообразования HEDP является нежелательным. Расчеты показывают, что при концентрации ионов натрия 0,1 моль/л (I=0.1) в области рН от 5 до 7 около 25% HEDP связано в комплекс NaH₂L, а при рН = 7 - 70%. При концентрации ионов калия 0,05 моль/л в области рН = 9 приблизительно 50% комплексона связано в комплексы щелочного катиона [19].

HEDP формирует с щелочными катионами не только устойчивые нормальные комплексонаты ML^3-, но и протонированные комплексы MH₂L^-. При этом речь может идти о формировании полноценных комплексов с хелатной структурой. На возможность наличия таковой у протонированных комплексонатов HEDP указывают результаты рентгеноструктурных исследований кристаллов Na₂H₂L ∙ 4H₂О и изоструктурного ряда MH₃L ∙ 2H₂O, где M = Na⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺ (табл. 2).

Табл. 2. Межатомное расстояние M-O (где M = Na⁺, K⁺, Rb⁺ и Сs⁺) [21].

№	Комплекс	Среднее межатомное расстояние М-О (Å)	КЧ катиона металла
1	KH3L ∙ 2H2O	2.880	7
2	RbH3L ∙ 2H2O	3.028	7
3	RbH3L ∙ 2H2O	3.030	7
4	RbH3L ∙ 2H2O*	3.028	7
5	CsH3L ∙ 2H2O	3.366	11
6	Na2H2L ∙ 4H2O	2.394; 2.471	6 →Na(1) 4 + 1 → Na(2)

В частности, для KH₃L ∙ 2H₂O показано [20], что каждый катион К⁺ помимо трех атомов кислорода «своего» лиганда координирует еще четыре атома кислорода соседних молекул HEDP (КЧ = 7). Соответственно каждый анион H₃L^- связан с четырьмя катионами К⁺. Присутствие тяжелых ионов Rb⁺ и особенно Cs⁺ ослабляет влияние межмолекулярных водородных связей на геометрию аниона, а фосфоновые и фосфонатные группы становятся различимыми. В комплексе иона цезия впервые для подобных комплексов обнаружены и четырехчленные металлоциклы [20].

Делая вывод по приведенным данным, заключаем, что HEDP могут образовывать комплексные формы с катионом калия, добавляемого в ходе титрования. Начиная с рН = 6, его концентрация уже в два раза превышает концентрацию HEDP, а при рН > 8 – в три и более раз. Все это дает основание для включения калиевых комплексов состава 1:1 (KHL^2-, KL^3-) и 2:1 (K₂L^2-), описанных в литературе [21], в матрицу стехиометрии.

Растворы 1-гидроксиэтилиден-1,1-дифосфоновой кислоты (HEDP) в диапазоне рН от 0,98-13,00 анализировали с использованием спектроскопии FT-Raman и ³¹P и ²³Na-ЯМР-спектроскопии. Для разных протонированных классов наблюдались вибрационные полосы в спектрах комбинационного рассеяния, тогда как для всех образцов наблюдался только один сигнал ЯМР, во всем диапазоне рН. Никакого значительного сдвига в сигнале ЯМР ²³Na не наблюдалось, это подтверждало, что образование комплексов Na⁺(aq) не происходило; следовательно, никакого взаимодействия с различными протонированными формами HEDP не произошло. В текущей работе, где измерения проводились в растворе, только один ³¹P-сигнал наблюдался на шкале ЯМР для каждого из образцов, изменяющихся в диапазоне 22,7-22,0 м.д. Однако по сравнению с появлением и исчезновением отдельных колебательных полос в спектрах комбинационного рассеяния появляется логическая последовательность. Существует превосходная корреляция между экспериментальными спектрами комбинационного рассеяния и ЯМР со сдвигом ³¹P-сигнала, близкой к значению зависящего от рН распределения всех форм HEDP [22].

Таким образом, поскольку изменение кислотности среды в растворе проводится путем добавления щелочи, следует учитывать возможность координации ионов щелочных металлов оксиэтилидендифосфоновой кислотой при обработке экспериментальных данных.

1.6. Использование ионов Mn²⁺ в МРТ

Авторами [23] было установлено, что комплексы на основе марганца могут рассматривается как альтернатива комплексам гадолиния (iii). Ион Mn²⁺ обладает всеми физическими свойствами, которые делают Gd³⁺ высокоэффективным зондом для визуализации в T₁-взвешенных МР-изображениях: оба иона характеризуется высоким спиновым квантовым числом (S = 7/2 для Gd³⁺, S= 5/2 для Mn²⁺), большим временем электронной релаксацией, а также быстрой кинетикой обмена воды. Mn²⁺ является биогенным и вводится внутривенно, он очищается через желчную экскрецию, что особенно выгодно для почек. Комплекс [Mn(DPDP)]^3- был одобрен в качестве визуализирующего агента для печени [23]. Было показано, что комплекс [Mn(DPDP)]^3- подвергается частичному растворению в плазме, а Mn²⁺ быстро поглощается гепатоцитами, поджелудочной железой и мышечными клетками сердца. Комплекс [Mn(DPDP)]^3- демонстрирует плюсы и минусы использования Mn²⁺. С одной стороны, использование комплекса [Mn(DPDP)]^3- даёт превосходный контраст изображения, а с другой, комплекс [Mn(DPDP)]^3- подчеркивает крайнюю лабильность иона Mn²⁺, и ставит задачу разработки стабильного хелата Mn²⁺.

Исследования также показали, что комплекс [Mn(PyC3A) (H₂O)]^- обеспечивает хороший контраст изображения, имеет ожидаемое внеклеточное распределение, и быстро выводится через почечный и печеночный каналы [23].

Авторами [24] был синтезирован и охарактеризован комплекс Mn-ЭДТА. Используя функциональность бензотиазол-анилина (BТА), они выявили его возможную диагностическую пользу при МРТ печени. Кинетическая инертность этого комплекса была значительно выше, чем MnDPDP и Mn-EDTA, и была сопоставима со стабильным комплексом Gd-DTPA. Кроме того, его релаксивность R₁(3470 М^-1 с^-1) была выше, чем у MnDPDP (R₁ = 2800 М^-1 с^-1) и Gd-DTPA (R₁ = 3300 М^-1 с^-1). МР-изображение живого организма показало, что комплекс Mn-EDTA-BTA является специфическим МР контрастным агентом для печени, который может использоваться как для почечной, так и для гепатобилиарной системы элиминации. Процесс выведения из организма этого комплекса имеет сходство с гепатобилиарным агентом на основе Gd, таких как Gd-DTPA-EOB и Gd-BOTPA. В заключении, на живом организме с заболеванием рака печени, комплекс Mn-EDTA-BTA значительно улучшал обнаружение и характеристики опухоли по сравнению с комплексом MnDPDP. Таким образом, они предположили, что комплекс Mn-EDTA-BTA может быть хорошим диагностическим МРТ контрастным агентом для рака печени [24].

Авторы [1] также отметили, что в результате исследований был одобрен для клинического использования контрастный агент, основанный на Mn²⁺ (MnDPDP, TESLASCAN). Важным преимуществом контрастного агента на основе Mn²⁺, по сравнению с контрастным агентом на основе Gd³⁺, является низкая токсичность свободного иона Mn²⁺. С другой стороны, меньшее число неспаренных электронов Mn²⁺ по отношению к аналогам Gd³⁺, как правило, приводило к более низкой релаксивности комплексов Mn²⁺ в высоких полях (> 20 МГц). Чтобы повысить релаксацию нужно было увеличить количество молекул воды, координирующих парамагнитный ион (q), так как вклад внутренней сферы в релаксация прямо пропорционален парамагнитному иону (q). Этот подход был успешно использован для увеличения релаксивности Gd³⁺, хотя, как правило, это снижало дентатность лиганда, вследствие увеличения количества гидратации, что приводило к более термодинамически низкой устойчивости комплексов. Были также предприняты некоторые попытки для получения бисгидратированных комплексов Mn²⁺ в качестве потенциальных контрастирующих агентов в МРТ, но ожидаемого усиления релаксации не было из-за низкой скорости обмена координированной воды с общим объемом воды. Вторым преимуществом контрастных агентов на основе Mn²⁺, является то, что они могут использоваться как зонды в МРТ, которые чувствительны к окислительному стрессу, при условии, что подходящий лиганд стабилизирует ионы Mn²⁺ и Mn³⁺ [1].

1.7. Использование ионов Gd³⁺ в МРТ

Контрастные вещества на основе гадолиния (GBCAs) широко используются в магнитно-резонансной томографии (МРТ), так как они обладают уникальной способностью повышать T₁-взвешенные изображения за счет увеличения скорости продольной релаксации протонов внеклеточной жидкости (1/T₁).

Даже если в настоящее время многие контрастные вещества используются в клинической практике, тем не менее существует большое количество докладов о новых комплексах Gd(III), направленных на улучшение основных релаксирующих свойств зондов или конкретной ориентации с использованием «быстрых» контрастных реагентов. Среди них растет интерес к фосфонированным комплексам, поскольку введение этих функции или замещение карбоновой кислоты фосфоновой показали, что они играют значительную роль в релаксации комплексов Gd(III). Во-первых, фосфоновая кислота обладает двумя константами диссоциации, во-вторых –у нее рН немного ниже нейтрального.

Ряд, состоящий из тетра-, трис- и бисфосфонированного лиганда (рис. 2) на основе пиридинового каркаса (L₄, L₃ и L₂, в указанном порядке), изучался, авторами научной работы [25], в рамках координации Gd(iii). Константы устойчивости комплексов, образованных катионом Gd³⁺, определялись потенциометрией в водных растворах (25^оC, 0,1 м NaClO₄), показывая, что тетрафосфонированные комплексы являются одними из наиболее стабильных комплексов Ln(III), описанных в литературе. Эксперименты по титрованию подтвердили образование высокостабильных комплексов [GdL₄]. Магнитно-релаксационные свойства комплексов Gd(III) изучали путем регистрации их ¹H-ЯМР-профилей при различных температурах, по температурным зависимостям ЯМР-экспериментов (GdL₄) и с помощью рН-зависимых измерений релаксивности при 0,47 Tл (GdL₃ и GdL₂). В дополнение к высоким значениям релаксирующей активности, наблюдаемым для всех комплексов, результаты показали важный вклад во внешнесферную релаксацию и вариации, зависящие от рН, связанные с образованием агрегатов для комплексов GdL₂ и GdL₃. Наконец, внутривенная инъекция комплекса GdL₄ на мыши сопровождалась функциональной МРТ-визуализацией при 1,5 Тл, которая показала, что комплекс может быть моментально обнаружен в кровотоке и быстро удаляется через печень и в значительной степени через почки.

Рис. 2. Молекулярные структуры лигандов L₂-L₄

Фосфонированные хелаты на основе пиридила представляют собой очень перспективные платформы для комплексообразования лантанидов Gd³⁺. В частности, комплексы, полученные с тетрафосфонированным лигандом(L₄) образуют комплексы с чрезвычайно высокой термодинамической стабильностью. Тем не менее, наличие многочисленных функций у фосфоната также сопровождается значительными последующими взаимодействиями, вероятно через водородные связи, особенно в кислых средах. Для изученных комплексов Gd(III) эти взаимодействия, другие и внешнесферные механизмы вносят существенный вклад в релаксивность соединений. Кроме того, снижение рН приводило к образованию агрегатов, которые сильно влияли на времена корреляции вращения и приводили к дальнейшему увеличению релаксивности. МРТ-визуализация на мышах показала, что комплекс GdL₄ хорошо подходит для усиления контрастности, в то время как небольшие изменения на лигандном каркасе, такие как пара-функционализация центрального пиридинового кольца, могут позволить увеличить время удерживания в кровотоке [25].

1.8. Использование ионов Fe³⁺ в МРТ

Синтезирован фторированный макроциклический комплекс Fe(III)-DOTAm-F12, и был измерен его потенциал в качестве контрастных агентов в магнитно-резонансной томографии. Высокая растворимость в воде этого комплекса и наличие одного сигнала фтора в ЯМР, эти два необходимых параметра для МРТ (на живом организме), являются существенными преимуществами по сравнению с используемыми в настоящее время органическими полифторуглеродами и другими сообщаемыми парамагнитными F-зондами. Чувствительность зондов фтора пропорциональна отношению T₂/T₁. В воде оптимальными комплексами металлов для приложений визуализации являются Fe(III), и в меньшей степени Tm(III) и Yb(III). К тому же, время T₁ комплексов лантанидов мало подвержен влиянию крови, время T₂ заметно короче в крови, чем в воде. Примечательно, что времена релаксации ядер фтора комплекса FeIII-DOTAm-F12 сходны в воде и в крови. Этот комплекс имеет самое большое значение отношений T₂/T₁ (0,57) и самый низкий предел обнаружения (300 мкМ) в крови. Сочетание высокой растворимости в воде, сигнала одиночного фтора и большого значения отношений T₂/T₁ в комплексе Fe-DOTAm-F12 облегчает получение трехмерных магнитно-резонансных изображений [26].

Были приготовлены три комплекса железа(III) с лигандами (1-H; 2-Br; 3-OMe, 3 заместителя у фенильной группы), полученными из N-этил-N- (2-аминоэтил) салицилальдимината, также был сделан рентгеноструктурный анализ(РСА). ЯМР-исследования растворов этих комплексов в ДМСО позволили исследовать их магнитное поведение и вклад в парамагнитую релаксацию. Измеренные величины релаксации составляли от 0,35 до 0,80 мМ ^-1с^-1, для протонных ларморовских частот от 0,01 до 300 МГц, что согласуется с известными другими контрастными веществами на основе железа(III). Биологические исследования на монослоях эпителиальных клеток толстой кишки показали, что соединения оказывают токсическое действие только при концентрациях выше 100 мкМ при одновременном снижении секреторной функции толстого эпителия. Эти две особенности делают эти комплексы хорошими кандидатами для дальнейшей разработки, чтобы их можно было использовать в качестве контрастных агентов для МРТ [27].

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Постановка задачи

Как следует из обзора литературы, существует достаточно много контрастных реагентов на основе ионов Gd(III), Mn(II) и Fe(III), что показывает актуальность их применения, но работ по изучению комплексообразования гадолиния(III), марганца(II) и железа (III) c HEDP в гетерогенной системе на данный момент отсутствуют.  Учитывая упомянутые моменты, в данной работе предполагалось провести совместное титрование Gd(III), Mn(II) и HEDP, а так же Gd(III), Fe(III) и HEDP c приблизительно 3-х кратным разбавлением в ходе титрования. На основе полученных данных, посредством математического моделирования, получить константы равновесия и константы устойчивости выявленных форм. Провести сравнительный анализ полученных констант по критерию устойчивости, с комплексными формами, полученными раннее [28, 29] с целью выявления наиболее подходящих форм, соответствующих условиям при использовании в МРТ в качестве контрастных агентов. Провести оценку релаксивности (коэффициента релаксационной эффективности) [30].

2.2. Методика эксперимента

2.2.1. Приборы и реактивы

Активность протонов определяли на потенциометре "Эксперт - 001" с точностью 0.005 ед. рН. рН-метр калибровался по стандартизованным водным буферным растворам.

Концентрацию раствора HEDP («Sigma») определяли pH-метрическим титрованием бескарбонатным раствором КОН, концентрация которого определялась титрованием раствором фиксанала (0.1 Н раствор НСl) в присутствии кислотно-основного индикатора фенолфталеина.

Времена протонной магнитной релаксации измеряли на "Портативном Релаксометре ПМР" (ООО "Идея-Резонанс", Казань) с рабочей частотой 12.2 мГц и «Minispec MQ-20» с рабочей частотой 19.75 МГц. Относительное среднеквадратичное отклонение измерений времен релаксации/амплитуда спин-эхо - 2%. Применяемые импульсные последовательности: для измерений Т₁ последовательность импульсов 180°-t-90° (где t - промежуток времени между соседними импульсами), для измерения Т₂ – методика Хана 90°-t-180° и последовательность импульсов 90°-t-(180°-2t) n - последовательность Карра-Парселла-Мейбума-Гилла (КПМГ), где n – число 180°-х импульсов [31].

Тестовое титрование с вытеснением углекислого газа аргоном показало, что подобная манипуляция не приводит к значимому отличию в кривых титрования при использованных концентрациях, поэтому основной массив данных получен без продувки аргоном. К выводу об отсутствии необходимости продувки аргоном пришли и авторы работы [32], изучавшие кислотно-основное поведение алендроновой кислоты (амино-функционализированной HEDP).

Для определения точной концентрации раствора нитрата марганца (II) (марки «ХЧ») его раствор титровали раствором ЭДТА при рН 10. Для определения точки эквивалентности использовали индикатор эриохром черный. Значение рН поддерживали с помощью ацетатного буфера [33].

Для определения точной концентрации раствора нитрата гадолиния(III), его титровали раствором ЭДТА при рН 5.6. Для определения точки эквивалентности использовали индикатор ксиленоловый оранжевый, рН поддерживали с помощью аммиачно-хлоридного буфера [34].

Для определения точной концентрации растворов нитрата железа (iii) (марки «ХЧ») его раствор титровали раствором ЭДТА. Для определения точки эквивалентности использовали индикатор сульфосалициловую кислоту [33].

Все экспериментальные серии включали не менее 3-х параллельных. Поскольку в системах, содержащих ионы металлов, в широких диапазонах рН присутствовали осадковые формы, особое внимание уделялось времени установления равновесного состояния, которое отслеживалось по установлению постоянного значения рН.