2.2.6 Определение лактозы по гост р 51259-99

В третью кювету спектрофотометра (фотометра) последовательно дозируют 0,20 см раствора НАД в цитратном буфере, 0,1 см прозрачного фильтрата по 8.4 и 0,02 см суспензии ГЗ. Содержимое кюветы перемешивают, осторожно встряхивая, и оставляют при комнатной температуре на 15 мин. Затем в кювету последовательно добавляют

1,00 см буферного раствора дифосфата калия и 1,90 см дистиллированной воды. Содержимое кюветы перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой и оставляют при комнатной температуре на 2 мин. Измеряют оптическую плотность - раствора относительно оптической плотности воздуха. В кювету добавляют 0,02 см суспензии ГДГ. Содержимое кюветы перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность - раствора относительно оптической плотности воздуха. Измерения оптической плотности растворов по 8.5.2.4 и 8.5.3.4 повторяют через каждые 2 мин до окончания реакции, что выражается в установлении постоянной оптической плотности раствора. Подобные измерения необходимо проводить при использовании ферментных препаратов с длительным сроком хранения.

2.2.7 Выражение результатов

После измерений оптических плотностей растворов рассчитывают изменения оптических плотностей растворов, которые вызваны окислением свободной галактозы и окислением свободной галактозы и галактозы, образовавшейся при гидролизе лактозы,

; (1)

. (2)

Изменение оптической плотности раствора , вызванное гидролизом лактозы, рассчитывают по формуле

. (3)

Массовую долю лактозы в пробе, г/100 г, рассчитывают по формуле

, (4)

где - молярная масса лактозы (безводная форма), 342,30 г/моль; молярная масса моногидрата лактозы, 360,31 г/моль (массовую долю моногидрата лактозы в пробе рассчитывают умножением массовой доли безводной лактозы на коэффициент 1,0588); - общий объем раствора в кювете, 3,24 см ; - объем, полученный при разбавлении пробы в процессе ее подготовки к испытанию по 8.3, 100 см ; - молярный коэффициент поглощения НАДН, дм ·ммоль ·см ; - при длине волны 340 нм - 6,3, - при длине волны 365 нм - 3,4 (ртутная лампа), - при длине волны 334 нм - 6,18 (ртутная лампа); - толщина поглощающего слоя в кювете, см; - объем пробы, 0,10 см ; - навеска пробы, г.

Массовую долюWr- галактозы в пробе, г/100 г, рассчитывают по формуле

, (5)

где Mr- молярная масса галактозы, 180,16 г/моль. За результаты испытаний принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленные до 0,1 г/100 г для лактозы и до 0,05 г/100 г для галактозы.

2.2.8 Сходимость

Абсолютное расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать более чем в 5% случаев 0,1 г/100 г для лактозы или 0,05 г/100 г для галактозы.

2.2.8 Фермен- тативного анализа в Стайлаб

Для определения уровня лактозы в молоке в соответствии с

ГОСТ Р 51259-99 Стайлаб предлагает ферментативный набор Лактоза/D-Галактоза. Предел обнаружения лактозы согласно данной методике составляет 0,007 г/л.

Официальным методом определения лактозы и галактозы в молоке и молочных продуктах в Россий- ской Федерации является ферментативный анализ (ГОСТ Р 51259-99). Он основан на гидролизе лакто- зы до глюкозы и галактозы, последующем окислении суммарного содержания галактозы в присутствии НАД+ и определении количества образовавшегося НАДH фотометрическим методом. Применительно к безлактозному

молоку и молочным продуктам, полученным с использованием ферментативного разложения, этот метод обладает существенным недостатком: лактоза в такой продукции уже была расщеплена в ходе производства, и содержащиеся в ней галактоза и глюкоза могут искажать результаты анализа

Существует альтернативная методика фермен- тативного анализа, в ходе которой перед анализом проводится удаление глюкозы, содержащейся в пробе. Затем лактоза под действием фермента рас- щепляется на галактозу и глюкозу, которая взаимо- действует с АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата. В присутствии фермента глюконат-6-фосфат-дегид- рогеназы

и НАДФ+ это вещество окисляется до глю- конат-6-фосфата. НАДФ+, в свою очередь, восста- навливается до НАДФH. Концентрацию последнего определяют с помощью фотометрии, и по ней рассчи- тывают содержание глюкозы, которое соответствует содержанию лактозы.

Спецификация	Yellow line Roche Diagnostics Лактоза/D-Галактоза
Количество определений	32 (проба, бланк или стандартный раствор)
Стандарт	раствор лактозы(концентрация указана на этикетке флакона)
Длина волны	340 нм, 334 нм или 365 нм
Матрицы	Молоко, кислое молоко, сгущенное молоко, сухое молоко, шоколад, сыры детское питание, мороженое, йогурт, колбасы, молокосодержащие продукты
, Пробоподготовка	При необходимости: разбавление, фильтрование, обесцвечивание, нейтрализация, измельчение, гомогенизация, депротеинизация, обезжиривание
Длительность анализа	, 37 минут
Специфичность	Лактоза, D-галактоза, лактулоза (с меньшей скоростью), L- арабиноза
Предел обнаружения	0,007 г/л (лактоза); 0,004 г/л (D-галактоза)
Стандарты, официальные методы определения лактозы по D-галактозе ферментативным методом	ГОСТ Р 51259-99, ГОСТ 31086-2002, ISO 5765-2:2002 (IDF 79 2:2002), DIN 10344 (1982), AOAC 984.15, NMKL 155, SLMB, LMB

Таблица 5. Yellow line Roche

Diagnostics Лактоза/D-Галактоза