2.5. Эксплантты агары бар ортаға отырғызу және өсіру әдісі

Құрамында фитогормондары бар қолайлы қоректік ортаға отырғызылған биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі ұлпалары дедифференцацияланып, бөліне бастайды да каллус ұлпаларын түзеді. Биобалистика әдісі ұлпаларын өсімдіктің әртүрлі мүшелерінен басқа асептикалық өскіндерден де алуға болады.

Каллусогенез процесі бастапқы экспланттың көлеміне, жасына, оның өсімдікте орналасқан жеріне және пайдаланылған коректік ортаға байланысты болады. Өсімдіктердін тұқымжарнағын, жапырағын және гипокотильін қолайлы коректік ортада өсіргенде төмендегідей морфогенетикалық өзгерістерге ұшырайды.

1.Эксплант бастапқы трансформацияны түзіп, одан әрі адвентивтік бүршік пайда болады;

2.Түзілген трансформация бастапқы және ауыстырмалы ұлпаларынан меристемалык бастамалар түзіледі;

Трансформация жағдайында түзілген қиярдың каллус ұлпалары алынған бастапқы эксплантына байланысты, әдетте қара-жасыл, қою-сары және сары-жасыл түсті болып келеді.

Консистенциясына байланысты созылмалы, борпылдақ және таңба тәрізді болады.

Өсімдік жапырағы трансформация

Жапырақ жасушаларын in vitro жағдайында қолайлы қоректік ортаға отырғызылғанда бұрынғы атқаратын қызметі мен құрылысын, құрылымын өзгертіп, дифференцацияланып бөліне бастайды, өте тез өсетін трансформация.

Жасушаларды қараңғы жағдайда өсіргенде жапырақ өзінің жасыл түсін өзгертіп, фотосинтездік қабілеттілігін жоғалтады.

Жапырақтан каллус алу үшін ортаңғы жүйкелердің аймағы өте қолайлы болып табылады.

Трансформация алу үшін стерильді пробиркалық өсімдік және стерильді емес жапырақтар пайдаланады (2- сурет).

2- сурет. Өсімдік жапырағының трансформациясы

2.6.Биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясының құрылымы

Маманданған ұлпаның кез келген тірі жасушалары лайықты қоректік ортада өсіргенде, өздерінің тотипотенттік қасиетін жүзеге асырып, регенерация арқылы бүтін өсімдікке айнала алады. Жеке жасушалардан сол өсімдік түріне тән барлық белгілері мен қасиеттері сақталған бүтін өсімдіктің түзілуі трансформация көбейту технологиясының негізін қалайды. Клон деген -жыныссыз жолмен, яғни вегетативтік көбею жолымен, түзілетін ағза.

Өсімдіктердің трансформация микрокөбеюі деген өсімдіктердің in vitro жағдайында жыныссыз жолмен көбеюі. Соның нәтижесінде пайда болған өсімдіктер бастапқы өсімдікпен және өзара бір-бірімен генетикалык тұрғыдан айнымастай бірдей болады.

Бұл биотехнологиялық әдістің дағдылы вегетативтік жолмен көбеюмен салыстырғанда бірталай артықшылықтары бар, атап айтқанда: көбею коэффициенті өте жоғары; микрокөбеюмен қатар өсімдіктер вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтырылады; сұрыптау процесін жылдамдату, жаңа сорттарды тез көбейтіп, оларды ауылшаруашылык өндірісінде пайдалану мерзімі едәуір қысқарады; вегетативтік жолмен көбейе алмайтын өсімдіктерді трансформация жағдайында көбейтуге болады; үнемділік; жас өсімдіктерді алу, кәрі дарақтарды жасарту; өсу процесін жыл бойы үзбеуге болады, әсіресе бұл дамуында тыныштық кезеңі болатын өсімдіктерді көбейтуге тиімді.

Трансформация микрокөбейту әдістері in vitro жағдайында қолтық бүршік меристемаларын өсіруге және басқа экспланттардан немесе каллустардан бүршіктер мен эмбриоидтарды өсіруге негізделген.

Трансформация микрокөбейту жұмысы 4 кезеңнен өтеді.

І-кезең. Эксплантты трансформация жағдайында өсіру. Бұл кезде толығымен залалсызданған эксплантты алып, лайықты қоректік ортаға отырғызып, оның жақсы өсуіне қолайлы жағдай туғызу керек. Бұл кезеңнің нәтижелілігі эксплантты дұрыс таңдап алуға байланысты. Ол үшін донор өсімдіктің әр даму кезеңінде ұлпаларынан немесе мүшелерінен экспланттар алынып, олардың in vitro жағдайында өсу және морфогенездік қабілеттері зерттеледі.

II -кезең. Микрокөбейту. Өркендердің пайда болуы және олардың санын көбейту.

III-кезең. Өркендерді тамырландыру және оларды сақтау. Жақсы тамыр жүйесі пайда болуына және дамуына жағдай туғызу. Ол үшін қоректік ортаға ризогендік факторы, яғни ауксин қосылады. Тамырлар өсіп жетілген соң өсімдіктерді топыраққа көшіруге дайындайды. Төмен температура өсімдіктердің дамуын тежеп, ұзақ уақыт сақтауға мүмкіншілік береді.

ІV-кезең. Өсімдіктерді топыраққа отырғызу. Өсімдіктерді топыраққа отырғызу алдында оларды арнайы дайындайды. Сол үшін ауаның ылғалдылығын және жарықтың қарқындылығын арттырады. Өсімдіктер гетеротрофтық қоректенуден антотрофтык қоректенуге өтеді. Бұл ұқыптылықты талап ететін ең маңызды кезең. Трансформация микрокөбейту нәтижесі өсімдіктің генотипіне, жасына, экспланттың тегіне, қоректік ортаға, өсіру жағдайларына байланысты.

Микроклональді көбейтуде тамыр түзуін индукциялау

Құрамында цитокинині бар қоректік ортада бүлдіргеннің апикальді меристемасын өсіргенде қолтык меристемаларының белсенділігі нәтижесінде бір төбе бүршіктер бірнеше сабақ бүршіктері пайда болады, өсу нүктелері ұлғайып, жаңа жапырақтары пайда болады. Бірақ бұл қоректік ортада тамыр пайда болмайды, ол үшін бүршіктерді құрамында ауксині бар жаңа қоректік ортаға отырғызу қажет.

Өсімдік материалдарын сауықтыру

Биотехнологиялық негізде вируссыз тұқым шаруашылығы - тауарлы шаруашылықтағы оның өнімділігі мен сапасын арттырудың ең тиімді жолы. Вируссыз тұқым шаруашылығы бірқатар сатылардан тұрады:

1. Сорттарды сауықтыру. Осы мақсатпен апикальді меристема әдісі немесе оның термо немесе химиотерапиямен байланысы кең көлемде қолданылады;

2. Зертханалық және жылыжайларда сауықтырылған өсімдіктерді жедел көбейту;

3. Біріншілік және таңдаулы тұқым шаруашылығымен айналысатын маманданған шаруашылықтардың қажеттілігін қанағаттандыратын көлемде далалық жағдайдағы меристемалық клондарды бір-екі жыл көбейту, біріккен трансформация материалдардың зақымдалуын бақылау;

4. Жоспарланған көлемде супер-супер таңдаулы және таңдаулы түрлерін алғанға дейін өнімнің сапасын сақтауға және қайталанатын инфекциядан сақтауға бағытталған арнайы технологияны сақтау арқылы арнайы тұқым шаруашылығында сауықтырылған негізгі материалды көбейту;

Ұштық меристеманы оқшаулау

Меристеманы жасыл немесе этиолирленген өскіндерінен бөліп алады. Меристеманың жасыл өскіндерден түзілуі техникалық процесс, онда олар жақсы ажыратылады және түзілуі кезінде зақымдануға төзімдірек болады. Бірақ этиолирленген меристеманы қолданғанда сауықтыру жұмыстарының тиімділігі жоғары болады, себебі мұндай өскіндердегі вирустар концентрациясы айтарлықтай төмен, сондай-ақ вирусы жоқ ұштық меристема аумағы жарықта өсірілген өскіндердікінен әлде қайда көп болады. Меристема 2 см немесе одан үлкен болып өскеннен кейін оны бөліп алады.

Трансформация өсіру жұмыстары сынапты-кварцті немесе БУВ типті бактериоцидті шамның көмегімен залалсыздандырылған микробиологиялық боксте жүргізіледі. Жұмысты бастар алдын жұмыс орнын (столды, бинокулярлы лупаны) және пробиркалары бар штативті спиртпен сүртеді. Өскіндермен жұмыс жасауға арналған құралдарды (пинцеттерді, скальпельдерді, инелерді) әрдайым қолданар алдында спиртке салып, содан соң от жалынына қару арқылы залалсыздандырып отырады.