Морозова_Маслов_Клеточная биотехнология растений [2010]

Издание учебное

Морозова Нина Георгиевна Маслов Михаил Александрович

Отдельные главы общей биотехнологии. Клеточная биотехнология растений

Учебное пособие

Подписано в печать ________________ Формат 60х84/16. Бумага писчая. Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов 1. Тираж 100 экз.

Заказ № _________

Московская государственная академия тонкой химической технологии имени М.В.Ломоносова.

Издательско-полиграфический центр. 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ

имени М.В.Ломоносова

Кафедра химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского

Н.Г. Морозова, М.А. Маслов

ОТДЕЛЬНЫЕ ГЛАВЫ ОБЩЕЙ БИОТЕХНОЛОГИИ. КЛЕТОЧНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Учебное пособие

Москва 2010

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.Воробьева Е.И., «Промышленная микробиология», Изд-во Московского университета, 1989.

2.Бирюков В.В., «Основы промышленной биотехнологии» М.: Колосс, 2004.

3.«Сельскохозяйственная биотехнология» под ред. акад. РАСХН В.С. Шевелухи, М.: Высшая школа, 2003.

3.Бейли Дж., Оллис Д., «Основы биохимической инженерии», в 2 т., М.:

Мир, 1989.

4."Биотехнология", в 8 т., М.: Высшая школа. 1987.

5.Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. "Молекулярная биология клетки", в 3 т., М.: Мир, 1994.

6.Рис Э., Стернберг М., "От клеток к атомам", М.: Мир, 1988.

7.Елинов П., "Химическая микробиология", М.: Высшая школа, 1989.

8.Рем Г., «Наглядная биохимия», М.: Мир, 2001.

9.Ленинджер А., «Биохимия», в 3 т., М.: Мир, 1988.

10.Эллиот В., Эллиот Д., «Биохимия и молекулярная биология», М.: Издво НИИБМХ РАМН, 2000.

11.Грин Н., Стаут У., Тейлор Д., под ред. Сопера Р., «Биология» в 3 т., М.:

Мир, 1980.

42

3

ВВЕДЕНИЕ

Биотехнология растительных клеток базируется на их способности к существованию и размножению in vitro, их тотипотентности и регенерации. Метод культивирования изолированных тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) используют в биотехнологии для сохранения и размножения ценных генотипов, эмбриогенезе (эмбриональное, или зародышевое развитие), оздоровлении посадочного материала и т.д.

Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехнологии следует рассматривать в трех направлениях. Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Как правило, вторичные метаболиты получают из каллусной ткани, выращенной на твердой (агаризованной) или жидкой (суспензионная культура) питательной среде. На основе клеточных технологий получают такие медицинские препараты, как диосгенин из клеток женьшеня дальневосточного, стероидные гликозиды из клеток диоскореи дельтовидной, антиаритмический алкалоид аймалин из клеток раувольфии змеиной, тонизирующие вещества из клеток женьшеня, используемые в медицине и парфюмерии. В последние годы особый интерес представляют исследования по культивированию в биореакторах изолированных клеток тиса ягодного – продуцента антиракового вещества таксола. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Преимуществом такого способа получения веществ вторичного синтеза является также возможность использовать для этой цели растения, не

4

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ ПРИ УСВОЕНИИ МАТЕРИАЛА

1.Внешние и внутренние факторы роста в развитии растений.

2.Гормоны растений. Структура, механизмы действия.

3.В чем различия между понятиями фитогормон и фиторегулятор?

4.Понятие о регенерации растений.

5.Что такое каллусная ткань?

6.Как получить каллусную ткань?

7.Каковы возможности ее использования в биотехнологии?

7.Что такое тотипотентность каллусных клеток.

8.Назовите основные типы морфогенеза в культуре каллусных тканей.

9.Как можно индуцировать различные типы органогенеза в культуре каллусных тканей?

10.Что такое дедифференцировка клеток?

11.Что представляют собой опухолевые и «привыкшие» ткани? Каково их сходство и различие c каллусными?

12.Перечислите этапы получения каллусной ткани.

13.Глубинное культивирование каллусной культуры.

14.Назовите основные компоненты питательных сред, используемых для каллусогенеза.

15.Протопласты. Методы получения.

16.Перечислите методы культивирования протопластов.

17.Каковы главные направления использования культуры изолированных клеток и тканей растений в биотехнологии?

18.Каковы особенности получения и культивирования изолированных протопластов?

19.Каковы условия хранения протопластов?

20.Как получают и используют культуру клеточных суспензий?

21.Что такое клональное микроразмножеиие растений?

41

преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

-получение генетически однородного посадочного материала;

-освобождение растений от вирусов за счет использования миристемной культуры;

-сокращение продолжительности селекционного процесса;

-размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

-возможность проведения работ в течение всего года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

-возможность автоматизации процесса выращивания.

Первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах. Среди них картофель, сахарная свекла, гвоздика, гербера, фрезия и некоторые другие. В настоящее время ведутся работы по применению метода микроразмножения к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использовании техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. Насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro. Это каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др. Работы в этом направлении проводятся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.

40

произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год.

Второе направление – это использование культуры изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала. Этот метод, получивший название «клональное микроразмножение растений», позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год.

Третье направление – использование изолированных клеток в селекции растений, дающее возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды: засуха, засоление почв, низкие и высокие температуры, фитопатогены, тяжелые металлы и др. Вместе с тем это направление предусматривает создание новых растений путем слияния изолированных протопластов и получения неполовых (соматических) гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов методами генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами.

ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ

Клетки высших растений относятся к эукариотическим и очень сильно отличаются от бактериальных – прокариотических. Жизненный цикл эукариотической клетки складывается из 2-х фаз: фазы деления и интерфазы. Деление клеток – это вопрос жизни для всех организмов. Сам процесс клеточного деления очень легко наблюдать в микроскоп. Однако, прежде чем клетка сможет разделиться, она должна удвоить свою массу и редуплицировать (удвоить) все свои компоненты. Только в этом случае обе дочерние клетки будут иметь все необходимое для того, чтобы начать свой собственный цикл развития, который закончится делением. Подготовка к делению совершается незаметно для глаза во время второй фазы роста - интерфазы – промежуток времени между двумя делениями. Так как для прямого микроскопического изучения более доступны митоз и

5

цитокинез, являющиеся наиболее короткими показательными фазами клеточного цикла, интерфаза, наиболее продолжительная фаза – изучена в значительно меньшей степени. Большая часть компонентов клетки синтезируется на протяжении всего интерфазного периода между последовательными митозами. Это размывает границы различных стадий в интерфазе растущих клеток.

Рис. 1. Жизненный цикл эукариотической клетки.

Выделяют 3 стадии: G1, S и G2. Стадия G1 – стадия начального роста. В этот период ДНК не образуется, идут обычные обменные процессы, связанные с поддержанием жизнедеятельности клетки. К концу стадии G1 наблюдается интенсивная подготовка к синтезу ДНК, выраженная в усиленном синтезе ферментов репликации. По окончании ее наступает следующий период интерфазы, названный стадией S, в который и осуществляется синтез ДНК. Завершающей стадией интерфазы является фаза G2 – фаза роста. Резко уменьшается синтез нуклеиновых кислот. Наблюдаются признаки разрыхления ядерной оболочки и затем полного ее исчезновения. Происходит организация ДНК в хроматиды и затем в хромосомы, которые начинают формировать два ядра. Наступает фаза М.

6

можно получать 0,4 г сухой массы на литр среды в день. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50-и литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем при выращивании на плантации. Учитывая высокую стоимость женьшеня (1 кг плантационного корня стоит 100-150 дол. США), биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма привлекателен.

Количественный и качественный состав вторичных метаболитов возможно менять за счет изменения состава питательной среды при выращивании клеток in vitro. Например, на культуре женьшеня было показано, что соотношение различных форм азота в питательной среде влияло на продуктивность стероидных сапонинов. Так, соотношение аммонийного и нитратного азота 1:3 приводило к увеличению биомассы, а соотношение 2:3 не оказывало влияния на продуктивность, но приводило к снижению накопления диосгенина. Повышенные концентрации сахарозы (5%) в среде более эффективны для роста массы клеток, а пониженные концентрации (1,5%) - на продуктивность диосгенина. Фитогормоны не оказывают существенного влияния на продуктивность культур по биомассе. В промышленном масштабе в России осуществлено получение биомассы женьшеня на Омутнинском биохимическом заводе в биореакторах объемом до 2,5 м3. В ТОО «Тэмбр» (г. Ярославль) осуществлено проточное культивирование клеток женьшеня в промышленных биореакторах объемом 7,5 м3.

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ

В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовать присущую ей тотипотентность (см. стр. 22), то есть под влиянием экзогенных (внешних) воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд

39

из различных семейств, синтезирующие вторичные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный – источник диосгенина, диоскорея дельтовидная – стероидные гликозиды, равольфия змеиная – продуцент антиаритмического алкалоида аймалина, стевия – стевиозид и т.д. В последние годы особый интерес представляют исследования по культивированию в биореакторах изолированных клеток тиса ягодного. Установлено, что клетки данного растения синтезируют вещество – таксон, которое является антираковым препаратом.

Таблица 4. Некоторые экономически важные продукты, синтез которых осуществлен в культуре клеток высшихрастений.

Экспериментально доказано, что прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Например, за год прирост корня женьшеня в тайге составляет 1 г, на плантации – 3 г. При выращивании клеток корневого происхождения на агаре (in vitro)

38

Она включает две последовательные стадии – деление ядра (митоз) и деление цитоплазмы (цитокинез). Фаза М начинается с митоза и заканчивается цитокинезом. В начале фазы М удвоенные хромосомы, находившиеся ранее в диспергированном интерфазном состоянии, конденсируются и становятся хорошо видимыми в световой микроскоп. Ядерная оболочка окончательно разрушается и происходят координированные перемещения хромосом, приводящие к разделению пар сестринских хроматид. После окончания деления ядра образуются две новые ядерные оболочки, а затем делится цитоплазма, в результате чего получаются две дочерние клетки, имеющие по одному ядру. Процесс цитокинеза завершает фазу М, и начинается интерфаза следующего клеточного цикла.

Вариации в продолжительности клеточного цикла связаны, в основном, с продолжительностью фазы G1. Интерфаза обычно занимает не менее 90% времени всего клеточного цикла. Длительность ее не постоянна и колеблется от нескольких часов до нескольких суток. Добавление гормонов уменьшает длительность этой фазы. Например, у быстро делящихся клеток высших эукариот последовательные митозы, прерывающие интерфазу, происходят один раз в 16-24 часа. Продолжительность стадии S составляет для большинства клеток примерно 6-8 часов, а каждая М-фаза длится всего лишь 1-2 часа. Для наиболее быстроделящихся клеток высших организмов продолжительность клеточного цикла сокращается до 6-8 часов.

РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ

Процесс роста и развития любого организма определяется генетической программой, заложенной в его ДНК.

В самом широком смысле рост – это не только необратимое увеличение сухой массы как результат клеточного деления и увеличения

7

размеров клеток, но также и последующий процесс развития. Рост является результатом взаимодействия между ДНК и факторами внешней и внутренней среды организма. Развитие растений сопровождается образованием специализированных клеток, взаимное расположение которых образует фенотипическую форму растения1. Клетки в высших растениях не делятся бесконтрольно, как бактериальные. Процесс образования специализированных клеток носит название дифференциации. Между клетками происходит разделение труда. Степень дифференцировки клеток связана с уровнем филогенетической организации (Табл. 1).

Табл. 1. Приблизительное число клеток и клеточных типов как отражение степени дифференцировки, наблюдаемой на разных ступенях филогенетического развития.

Во время роста растения клеточное деление происходит почти исключительно в специализированных участках – меристемах2. Они бывают 2-х типов (рис. 2):

- апикальные меристемы на верхушках растущих побегов и на кончиках корней, обеспечивающие главным образом рост растения или его частей в длину (высоту);

1Фенотип – это совокупность внешних признаков организма, определяемых генотипом и условиями выращивания.

2Меристемы – образовательные ткани с активно делящимися недифференцированными клетками

8

По сути дела, все перечисленные методы основаны на использовании выделений из делящихся клеток – кондиционирующего фактора. Несмотря на многочисленные попытки определить химическую природу и раскрыть механизм действия кондиционирующего фактора на деление клеток, добиться этого пока не удалось. Однако уверенно можно сказать, что этот фактор термостабилен, водорастворим, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами. Исследования показали, что это не однородное вещество, а смесь соединений, выделяемых из клетки.

Питательные среды для культивирования протопластов аналогичны средам для каллусных культур.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ВТОРИЧНОГО СИНТЕЗА

Существующие методы культивирования изолированных клеток позволяют использовать их как для фундаментальных исследований, так и для практического применения. Особый интерес представляет способность изолированных клеток, тканей и органов синтезировать вещества вторичного метаболизма, которые широко используются в медицине, защите растений, ветеринарии, кормопроизводстве, пищевой промышленности, парфюмерии и т.д. Это связано с тем, что клеточная биотехнология для получения физиологически активных веществ имеет ряд преимуществ по сравнению с использованием традиционного растительного сырья: 1) получение биомассы клеток не зависит от сезона, климатических и почвенных условий; 2) возможность оптимизировать условия культивирования суспензии клеток, позволяющих синтезировать

внеобходимом количестве нужные вещества; 3) автоматизация процесса.

Винституте физиологии растений РАН в отделе биологии и биотехнологии собрана большая коллекция клеточных культур растений

37

недостатком метода является неизбежное частичное разрушение протопластов при заданном температурном режиме.

Другая группа методов основана на стимулировании деления одиночных протопластов под влиянием кусочков каллусной ткани («няньки»), отделенных от нее фильтрованной бумагой. В присутствии «няньки» одиночная клетка делится и дает индивидуальную колонию клеток – клон. При таком подходе различают 1) метод совместной культуры и 2) метод кормящей культуры.

В методе совместной культуры выбирают вид протопластов, растущих быстрее основных и легко потом отделяющихся. Быстро растущие вспомогательные клетки выделяют в среду вещества, стимулирующие рост основных протопластов.

Метод кормящей культуры отличается от предыдущего тем, что вспомогательные быстрорастущие клетки предварительно облучают дозой γ- и Х-лучей, лишающих их способности к размножению. Но они также поддерживают рост основных протопластов.

Рис.6. Использование в качестве «няньки» культуры суспензионных клеток при выращивании изолированных протопластов и одиночных клеток. 1 – колонии клеток; 2 – фильтровальная бумага; 3 – алюминиевая сетка; 4 – пенополиуретан; 5 – суспензия клеток.

36

- латеральные меристемы – цилиндрические прослойки незрелых клеток, дающие начало таким тканям, как древесина и кора, и

фитогормоны.

9

ФИТОГОРМОНЫ

Согласно современным представлениям о регуляторах роста и развития растений, фитогормонами называют вещества, которые синтезируются в растениях, транспортируются по ним и в малых концентрациях способны вызывать ростовые или формативные эффекты по месту образования и на расстоянии от него. Таким образом, первая особенность фитогормонов – эндогенное происхождение. Большинство фитогормонов образуется из органических кислот, в частности – аминокислот. Изменения в интенсивности синтеза того или иного фитогормона, вызванные внутренними или внешними причинами, приводят к ответной реакции растения – изменению показателей ростовых или формативных процессов.

Вторая особенность фитогормонов – передвижение их по растению. Биологический смысл этого условия заключается в том, что фитогормон, образовавшийся в одном органе, например в апикальной меристеме стебля, обладает свойством регуляции ростовых процессов в других органах, например в корне. Именно таким образом достигается взаимовлияние органов на целостность растения. Ряд веществ, обладающих высокой регуляторной способностью, например некоторые фенольные соединения, не могут быть признаны фитогормонами, так как неспособны к передвижению по растению и воздействуют лишь в месте своего синтеза.

Третья особенность – способность в малых концентрациях вызывать заметные ростовые или формативные эффекты. Фитогормоны действуют на растение в малых концентрациях (10-13-10-8 М). Примером ростового эффекта может служить ускорение или замедление роста стебля, а

формативного – дефолиация3.

3Дефолиация– опадениелистьевсрастенийподвлияниемнеблагоприятныхфакторов

10

Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Другим важным направлением использования суспензии клеток является получение изолированных протопластов.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПРОТОПЛАСТОВ

Культивирование изолированных протопластов имеет свои трудности, связанные с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусная ткань. Чтобы заставить одиночные клетки делиться, разработаны специальные методы, которые можно подразделить на две группы.

Первая группа методов основана на использовании очень малых объемов богатой питательной среды и представляет собой культивирование одиночных протопластов в микрокапле. Подход предложен академиком Ю.Ю. Глебой. В микрокаплях удобно наблюдать за получением и делением клеток. Известно два таких метода: 1) метод жидких капель и 2) метод платированных капель.

В методе жидких капель суспензию протопластов помещают в загущенную жидкую питательную среду в виде капель, где они и растут, образуя агрегаты в центре капель. При этом трудно проследить за судьбой отдельного протопласта. Модификация метода сводится к использованию таких маленьких капель, в которых может жить один протопласт, который туда и помещают. Объем капли примерно 1 мкл.

Метод платирования заключается в рассеве протопластов в более плотной среде с агар-агаром при 40-45 оС. После охлаждения среда застывает и клетки фиксируются. После этого легко наблюдать все стадии роста протопластов: образование клеточной стенки – деление клеток – дифференцировка клеток – развитие растения. Существенным

35