Иммунотоксины

Как частный случай гибридного токсина могут рассматриваться иммунотоксины — химерные белки, включающие два домена, один из которых обладает свойствами антитела, а другой свойствами ферментативной субъединицы токсина. Первый домен обеспечивает связывание химерного белка со специфической молекулой или клеткой, второй инактивирует молекулу-мишень или убивает клетку.

Иммунотоксины — первое поколение МИБП, полученных на основе производных бактериальных токсинов, не имеющих аналогов в природе. Появление иммунотоксинов вызвано трудностями прицельного терапевтического воздействия на злокачественно переродившиеся клетки крови. Первым таким средством были немеченые мАт, индуцировавшие апоптоз клеток-мишеней после взаимодействия с их рецепторами или вызывавшие их гибель по другим механизмам (rituximab и alemtuzumab). Однако в процессе клинических испытаний выяснилось, что более чем у половины пациентов раковые клетки устойчивы к действию мАт. Тогда их стали конъюгировать с радионуклидами. Эти агенты оказались эффективными для лечения пациентов со злокачественными новообразованиями, резистентными к мАт, но не могли использоваться широко из-за их дозозависимой токсичности для клеток костного мозга. Третий тип препаратов для прицельного терапевтического воздействия на злокачественные клетки представлял собой мАт с конъюгированными химиопрепаратами. Они оказались более эффективными и вызывали меньшее количество неспецифических осложнений при лечении острой миелоидной лейкемии (acute myelogenous leukemia, AML), чем мАт, конъюгированные с радионуклеотидами. Но и к ним были обнаружены резистентные опухолевые клетки, что потребовало дальнейшего совершенствование препаратов, действующих через специфическое узнавание рецепторов на поверхности опухолевых клеток [21].

Рис. 7. 3D-модели токсинов семейства Cry с модифицируемыми участками. А. Токсин Cry1A. Стрелками показаны точечные мутации в доменах I и II. Делетированный N-концевой регион обозначен черным цветом (Cry1AMod-токсин). Мутации N372A или N372G, локализованные в петле 2 домена II, ведут к восьмикратному увеличению токсичности по отношению к Lymantria dispar. Тройной мутант — N372A, A282G и L283S — показывает 36-кратное увеличение токсичности. Б. Токсин Cry3A. Стрелками показаны точечные мутации в домене II, улучшающие его инсектицидную активность. Созданный протеолитический сайт, включенный в домен I, показан черным цветом. В. Токсин Cry2A. Черным цветом показан N-концевой регион токсина, делетированный для улучшения его инсектицидной активности. По [31].

Способность иммунотоксинов к прицельному уничтожению раковых клеток начинается с одной молекулы ферментативной субъединицы токсина, доставленной к поверхности клетки-мишени специфическим антителом. Поэтому иммунотоксины представляют собой некий предел в развития таких средств терапии злокачественных опухолей крови. В качестве ферментативной молекулы при конструировании иммунотоксинов используют ферментативные субъединицы (домены) токсинов, блокирующие белковый синтез в клетках. Среди растительных токсинов наиболее часто используются рицин и абрин; среди бактериальных — одноцепочечные токсины: дифтерийный и экзотоксин псевдомонад.

Разработчики иммунотоксинов учитывают то обстоятельство, что обе субъединицы токсина содержат большое количество карбоксильных групп, связывающих их с неизмененными тканями, и, в частности, с тканями печени и почек. Поэтому прежде чем конъюгировать их с антителом, субъединицы дегликозилируют различными способами (получая рекомбинантные формы токсина в кишечной палочке, химическим путем и др.).

Оптимальным объектом для лечения иммунотоксинами являются опухолевые заболевания системы крови. Злокачественные клетки расположены внутри сосудов и доступны для препарата при внутривенном введении. К тому же иммунная система таких пациентов часто утрачивает способность к эффективному антительному ответу на сам иммунотоксин. Конструирование иммунотоксинов, используемых в медицинских целях, предполагает повышение их специфичности именно к опухолевым клеткам и как можно большую их безопасность для клеток нормальных тканей. В клинике токсичность таких препаратов оценивают по так называемой максимальной переносимой дозе (maximum tolerated dose, MTD). Признаки ее превышения неспецифические: астения, подъем уровня печеночных трансаминаз в крови, гипотензия. При появлении таких симптомов дозу препарата снижают. При более высокой дозе иммунотоксина у пациента может развиться синдром пропускания сосудов (vascular leak syndrome, VLS; Clarkson syndrome), вызванный высвобождением цитокинов после гибели периваскулярных Т-клеток. Основные симптомы: гипотензия, гипоальбуминемия без альбуминурии, генерализованный отек, низкий гематокрит. Количества иммунотоксинов, вызывающих осложнения, находятся в пределах десятков мкг на кг веса пациента [21].

Рис. 8. График токсоиды по Н.С. Антонову. Максимальная токсичность «супертоксинов» достигается за счет предельного увеличения размеров и сложности их молекул.

Максимально возможная токсичность

Выше мы уже приводили примеры повышения поражающего действия токсинов, но где пределы их «усовершенствования»? Пытаясь понять причину остановки роста токсичности новых боевых отравляющих веществ (ОВ) во второй половине ХХ в., Н.С. Антонов [2] исследовал имеющиеся в научной литературе данные по токсичности большого количества структурно-родственных веществ со сходным характером токсического действия. Он установил, что каждая такая группа веществ имеет границу минимальных летальных доз (ГМЛД), которая в логарифмических координатах «LD₅₀ (моль/кг) — молекулярная масса» представляет собой параболовидную кривую, причем наиболее токсичным веществам множества соответствуют строго определенные значения молекулярной массы. Используя приемы математической статистики, Антонов установил еще одну закономерность. Если на евклидовой поверхности в логарифмических координатах «LD₅₀ — молекулярная масса» отобразить весь массив веществ, для которых летальные дозы экспериментально установлены, то плоскость графика оказывается разделенной на две части: на одной из них сосредоточены отображения всех взятых веществ, в то время как другая часть плоскости графика остается свободной, ибо в природе не существует веществ, которые по величине летальной дозы и молекулярной массы соответствовали бы этой части плоскости графика (рис. 8).

Между указанными частями плоскости графика отчетливо прослеживается граница, формируемая отображениями наиболее токсичных веществ в соответствующих интервалах изменения величины молекулярной массы. Сохранены отображения только наиболее токсичных веществ и проведена кривая, огибающая эти отображения со стороны минимальных летальных доз. Эта кривая названа им «токсоидой». Наиболее токсичному веществу — ботулиническому токсину, соответствует и наибольшая молекулярная масса.

Эффект возрастания биологической активности по мере увеличения молекулярной массы отмечался ранее Н.И. Кобозевым у алкалоидов, гликозидов, гормонов, витаминов и синтетических лекарственных веществ. Им было показано, что путем вариации состава и строения молекул можно добиться некоторого увеличения активности веществ. Но если требуется добиться увеличения активности в десятки и более раз, одних структурных изменений молекул уже недостаточно, требуется переход к соединениям с большей величиной молекулярной массы [2], т.е. более сложно организованных.

ММ ботулинического токсина составляет 150 кДа [4]. ММ типичной белковой цепи достигает 50 кДа, размер лишь немногих пептидов превышает эту среднюю величину [1]. ММ ботулинических токсинов приближается к верхнему пределу возможных молекулярных масс белков. Из закономерностей, установленных Н.С. Антоновым и Н.И. Кобозевым, следует, что ММ токсинов с LD₅₀, меньшей на один порядок, чем у ботулинического, должна превышать 1,5 мДа (описано лишь несколько белков с такой массой), — на два порядка — 15 мДа (такие белки не описаны).