Биохимические процессы, протекающие при культивировании молочнокислых бактерий

Молочнокислые бактерии делятся на две большие группы: гомоферментативные (лактобактерии) и гетероферментативные (бифидобактерии), которые, в свою очередь, могут быть облигатными и факультативными.

Гомоферментативные бактерии (S. lactis, S. cremoris, L. casei, L. lactus и т.д.) – в результате брожения образуют из глюкозы в основном молочную кислоту:

глюкоза → глюкозо-6-фосфат → фруктозо-1,6-дифосфат →

фосфоенолпируват → пировиноградная кислота → молочная кислота

У этих микроорганизмов расщепление глюкозы идет по гликолитическому пути (ФДФ-пути) с образованием пирувата.

Бактерии располагают для этого всеми необходимыми ферментами, включая альдолазу. Затем благодаря наличию у них фермента лактатдегидрогеназы ПВК превращается в молочную кислоту.

У гетероферментативных молочнокислых бактерий (S. citrovorus, S. acetonicus, S. faecalis, S. bovis) отсутствуют основные ферменты ФДФ-пути (альдолаза и триозофосфатизомераза).

Начальное расщепление у них глюкозы происходит исключительно по пентозо-фосфатному пути (ПФ-пути), то есть через глюкозо-6-фосфат и рибулозо-5-фосфат, из которого в последующем синтезируется молочная кислота. Наряду с молочной кислотой образуется уксусная кислота и этанол:

глюкоза → глюкозо-6-фосфат

глицеральдегид-3-фосфат → пировиноградная кислота

молочная кислота → уксусная кислота → этанол

Наряду с ними образуется глицерин, а также диацетил и ацетилметилкарбинол – ароматические вещества, придающие определенный аромат кисломолочным продуктам и сливочному маслу.

Стандартизация лекарственных средств на основе пробиотиков

Стандартиззация пробиотиков проводится по следующим показателям:

Описание, упаковка, маркировка в соответствии с требованиями фармакопейной статьи производителя.

Идентификация: проводится микроскопическое исследование с последующим подтверждением вида микроорганизма по биохимическим и культуральным свойствам.

Лекарственные средства на основе пробиотиков должны иметь определенный рН. рН контролируют потенциометрически. Лиофильные формы проверяются на содержание влаги (потеря в массе при высушивании), растворимость.

Обязательно контролируется микробиологическая чистота.

Проверяется загрязненность другими микроорганизмами, в т.ч. патогенными. Для этого готовят мазки и окрашивают их по Граму. Должны быть только грамположительные палочки, расположенные в коротких цепочках или беспорядочно. Либо проводят посев на среду Сабуро, агар Эндо или мясопептонный агар и культивируют при 37±1ºС в течение 8, 2 и 8 суток соответственно. Не должно быть роста микроорганизмов.

Также проводится тест на специфическую безопасность. Для этого 5 белым мышам обоего пола массой 14–16 г вводят перорально по 0,5 мл суспензии, полученной путем растворения одной дозы в изотоническом растворе натрия хлорида. Наблюдают в течение 5 суток и фиксируют изменение массы мышей. В случае гибели хотя бы одной мыши или при снижении групповой массы после проведения испытания (в сравнении с исходной групповой массой), испытание повторяют на удвоенном количестве животных.

Испытание на специфическую активность лактобактерий можно проводить двумя способами. Во-первых, по количеству жизнеспособных бактерий в 1 дозе. Во-вторых, по способности к кислотообразованию (титриметрически).

Первое испытание. Суспензию, полученную из одной дозы, разводят и получают серию разведений. Высевают на среду МРС-4. Культивируют 40–48 ч при 37±1ºС. Производят подсчет колоний и расчет содержания живых бактерий в одной дозе.

Второе испытание. Содержимое разводят средой МРС-4 и инкубируют при 37±1ºС в течение 48 ч. Затем титруют содержимое 0,1 М натрия гидроксидом в присутствии фенолфталеина до стойкого слабо розового окрашивания.

Расчет ведут по формуле:

ºТ=А×К×10,

где ºТ – условная величина, выраженная в градусах Тернера;

А – количество миллилитров раствора натрия гидроксида в концентрации 0,1 моль/л, пошедшего на титрование 10 мл исследуемой суспензии;

К – поправка к титру раствора натрия гидроксида.

Дополнительно проверяют состав компонентов среды высушивания для лиофилизированных лекарственных форм.