Строение и функции атф
Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) — универсальный источник и основной аккумулятор энергии в живых клетках. АТФ содержится во всех клетках растений и животных. Количество АТФ в среднем составляет 0,04% (от сырой массы клетки), наибольшее количество АТФ (0,2–0,5%) содержится в скелетных мышцах.
АТФ состоит из остатков: 1) азотистого основания (аденина), 2) моносахарида (рибозы), 3) трех фосфорных кислот. Поскольку АТФ содержит не один, а три остатка фосфорной кислоты, она относится к рибонуклеозидтрифосфатам.
Для большинства видов работ, происходящих в клетках, используется энергия гидролиза АТФ. При этом при отщеплении концевого остатка фосфорной кислоты АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфорную кислоту), при отщеплении второго остатка фосфорной кислоты — в АМФ (аденозинмонофосфорную кислоту). Выход свободной энергии при отщеплении как концевого, так и второго остатков фосфорной кислоты составляет по 30,6 кДж. Отщепление третьей фосфатной группы сопровождается выделением только 13,8 кДж. Связи между концевым и вторым, вторым и первым остатками фосфорной кислоты называются макроэргическими (высокоэнергетическими).
Запасы АТФ постоянно пополняются. В клетках всех организмов синтез АТФ происходит в процессе фосфорилирования, т.е. присоединения фосфорной кислоты к АДФ. Фосфорилирование происходит с разной интенсивностью при дыхании (митохондрии), гликолизе (цитоплазма), фотосинтезе (хлоропласты).
АТФ является основным связующим звеном между процессами, сопровождающимися выделением и накоплением энергии, и процессами, протекающими с затратами энергии. Кроме этого, АТФ наряду с другими рибонуклеозидтрифосфатами (ГТФ, ЦТФ, УТФ) является субстратом для синтеза РНК.
Методы исследования биологических обьектов
Современная биология располагает большим разнообразием ме- тодов, позволяющих изучать структуру и функции живых и фиксированных клеток на микроскопическом и субмикроскопическом уровнях. Наиболее широко применяются следующие методы:
• прижизненное окрашивание; • темнопольная микроскопия; • флуоресцентная микроскопия; • фазово-контрастная микроскопия; • культивирование клеток и тканей; • электронная микроскопия; • рентгеноструктурный анализ; • цито- и гистохимия; • цитоспектрофотометрия; • дифференциальное центрифугирование; • гистоавторадиография.
Световая микроскопия
Схема строения светового микроскопа представлена на рис. 1. Окуляр (1): увеличивает изображение, получаемое в линзах объектива; в окуляр может быть вставлена измерительная сетка, если необходимо измерить размеры объекта.
Тубус (2): трубка, по которой свет проводится от объектива к окуляру; может перемещаться в штативе для фокусировки изображения объекта.
Револьверная головка (3): в нее вставлены 2, 3 или 4 объектива. Головка поворачивается так, чтобы можно было использовать объективы с разным фокусным расстоянием (а значит, и с разным увеличением).
Объектив (4): увеличивает изображение объекта.
Объект исследования (5): закреплен на прозрачной стеклянной пластине (предметное стекло).
Предметный столик (6): удерживает объект в нужной позиции по отношению к оптической системе микроскопа.
Конденсор (7): фокусирует лучи света от осветителя на объекте исследования.
Ирисовая диафрагма (8): регулирует вели- чину светового потока к объекту. Лучшее разрешение достигается при уменьшении осве- щения (а не при увеличении). Для освещения чаще всего используется белый свет. Для повышения разрешения применяется свет коротковолновой части спектра (например, синий), излучаемый специальной лампой или системой фильтров. Свет на объект должен падать только из-под предметного столика. Диаметр типичной клетки приблизительно 10–20 мкм, что в 5 раз меньше размеров мельчайшей видимой частицы глазом, так как разрешающая способность человеческого глаза 100 мкм (0,1 мм). Метод сравнительной микроскопиии используется для исследования двух объектов путем визуального наблюдения или фотографирования. В поле зрения микроскопа сравниваемые объекты видны одновременно. Метод используется в различных областях биоло- гии и медицины.
Метод прижизненного (витального) окрашивания основан на использовании очень низких концентраций красителя (растворы от 0,1% до 0,01%). В такой концентрации красители являются малотоксичными для клеток. Чаще используют конгорот, нейтральный красный, трипановый синий и другие соединения ароматического ряда. В живой клетке при введении красителя наблюдается гранулообразование, в погибающей — диффузное окрашивание. По способности клеточных структур воспринимать краситель можно судить о степени повреждения клетки. Таким образом, метод позволяет судить о жизнедеятельности клеток при различных внешних воздействиях.
Метод микроскопирования в темном поле (темнопольная микроскопия) используется для рассматривания особо мелких структур (менее 0,2 мкм). Метод основан на том, что мелкие структуры, невидимые при обычном микроскопировании, светятся в отраженных лучах (эффект Тиндаля: светящиеся пылинки в луче солнечного света). Используется специальный конденсор, который пропускает только косые краевые лучи источника света. Поскольку краевые лучи имеют сильный наклон, они не попадают в объектив и поле зрения оказывается темным, а объект — светлым.
Флуоресцентная микроскопия основана на том, что некоторые вещества и структуры способны светиться (флуоресцировать, люминисцировать) при поглощении световой энергии. Для наблюдения флуоресценции используют либо фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области, либо ультрафиолетовые и люминисцентные микроскопы. Собственной (естественной) флуоресцен- цией обладают: хлорофилл, витамины А, В12, некоторые гормоны. Хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Для изучения структур и веществ, не обладающих естественной флуоресценцией, можно использовать флуорохромы (флуоресцирующие красители). Флуорохром акридиновый оранжевый избирательно соединяется с нуклеиновыми кислотами и при рассмотрении срезов в ультрафиолетовых лучах ДНК светится зеленым, а РНК — красным цветом. Таким образом, этот метод позво- ляет изучать локализацию различных химических веществ в живой и фиксированной клетке. Существуют флуорохромы, избирательно связывающиеся с липидами, полисахаридами, кератином и др.
Фазово-контрастная микроскопия основана на том, что отдельные структуры прозрачной в целом клетки отличаются друг от друга по плотности и светопреломлению. Проходя через структуры различной плотности, луч света изменяет свою фазу, но наш глаз не способен улавливать этот сдвиг фазы. Глаз чувствителен только к изменениям интенсивности света (яркости), последняя зависит от величины амплитуды световой волны. Специальный объектив вызы- вает дополнительный сдвиг фазы колебания. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе, но обладающие разной амплитудой. Тем самым создается черно-белое контрастное изображение объекта.
Методы цито- и гистохимииоснованы на способности красителей избирательно окрашивать химические вещества. Методы используют- ся для изучения химического состава тканей и клеток при сохранении их структуры, а также для определения локализации химических ве- ществ. Например, реакция Фельгена на ДНК или окраска метиловым- зеленым-пиронин на нуклеиновые кислоты (метод Браше). В основе реакции Фельгена лежит кислотный гидролиз ДНК на срезе фиксиро- ванной ткани, в процессе которого от ДНК отщепляется альдегидная группа, которая и реагирует с реактивом Шиффа (фуксинсернистой кислотой). В итоге ДНК хроматина приобретает яркую красно-фио- летовую окраску. При окраске по методу Браше пиронин связывается с РНК, окрашивает ее в розовый цвет, а метиловый зеленый связывает- ся только с ДНК, окрашивая ее в сине-зеленый цвет.
Метод цитоспектрофотометрии основан на том, что интенсивность поглощения лучей прямо пропорциональна концентрации вещества. При помощи специального прибора (микроспектрофотометра) измеряется оптическая плотность окрашенных цито- и гисто- химическими методиками субстратов (нуклеиновых кислот, белков, углеводов, ферментов). Величина оптической плотности характе- ризует концентрацию изучаемого вещества в структурах. Для количественного анализа необходимо знать площадь и объем структур (ядер, цитоплазмы), в которых измеряется оптическая плотность субстрата. Количество вещества выражается в условных единицах (ДНК можно выразить в единицах плоидности, если отфотометрировать в качестве стандарта сперматиды семенников (n) или лимфоциты крови (2n)). Метод применяется для изучения плоидности ядер, для изучения концентрации РНК, полисахаридов, белков и других веществ при развитии патологического процесса или при экспериментальном воздействии.
Метод гистоавторадиографии основан на использовании радиоактивных изотопов: трития (Н3), S35, С14 и др. Когда какое-либо вещество, содержащее радиоактивный атом, вводят в живую клетку, то клетка использует его наравне с нерадиоактивными изотопами для синтеза новых веществ. Меченый атом, таким образом, становится изотопным индикатором. Тритий используют в составе тимидина (для ДНК), уридина (для РНК), S35в составе метионина (для белка). Следы разлета частиц, которые испус кают распадающиеся радиоактивные изотопы, регистрируют путем нанесения светочувствительной эмульсии на гистологический препарат. В местах прохождения частиц светочувствительная эмульсия засвечивается, а после проявления эти участки выглядят как черные точки (треки). Чем интенсивнее изотоп включается в метаболизм, тем больше треков будет на препарате. Треки видны только над теми структурами, в составе которых появились радиоактивные молекулы. Так, например, Н3-тимидин входит в состав только молекулы ДНК, а основная масса ДНК локализована в ядре — следовательно, треки будут только над ядрами, и только над теми, в которых идет синтез ДНК. Метод используется для изучения обменных процессов (репликации ДНК, синтеза белка) на клеточном и тканевом уровнях.
Метод культивирования клеток и тканей основан на выращивании (эксплантации) изолированных клеток, кусочков тканей, орга- нов вне организма (in vitro). Различают клеточное, тканевое и органное культивирование. При клеточном и тканевом культивировании отдельные клетки или кусочки ткани выращивают погруженными в питательную среду. Такой способ позволяет сохранить морфологическую структуру культивируемых клеток, тканей. Культуры клеток дают возможность получить однородный клеточный материал в больших количествах. На клеточных культурах можно изучать физические и химические воздействия. На культурах клеток разработан комплекс специальных методов, в том числе гибридизация соматических клеток и образование гетерокарионов. При органном культивировании клетки кусочки ткани или органа (чаще всего взятые у эмбриона) выращивают на поверхности питательной среды. Кусочек органа или ткани в стерильных условиях извлекают из эмбриона, измельчают (до 0,2 мм), промывают в растворе Хенкса и помещают на поверхность мембранного фильтра, расположенного на плотике из органического стекла. Плотик помещают в чашку Петри с питательной средой так, чтобы нижняя поверхность фильтра касалась поверхности питательной среды. Питательная среда включает сбалансированный состав аминокислот, всех необходимых солей, сюда добавляется бычья сыворотка, куриный эмбриональный экстракт, витамин С, глюкоза, антибиотики. Чашки Петри помещают в термостат при 37 °С. Смена питательной среды проводится каждые два дня. При этом в стерильных условиях плотик с фильтрами и с кусочками тканей переносят в новую чашку Петри со свежей питательной средой. В таких условиях можно наблюдать за эксплантатом в течение длительного времени (28 и более суток). Органное культивирование позволяет сохранить морфологическую структуру выращиваемого органа, свойственную ему в условиях целого организма. При этом сохраняется не только морфологическая структура, но и функциональные свойства ткани, что позволяет наблюдать процессы дифференцировки, пролиферации, выявлять действие биологически активных веществ на культуру, проследить за динамикой возникающих изменений.