3.1.3Преимущество хл

Непосредственный химический анализ радикалов невозможен, так как

в отличие от обычных молекул их нельзя ни выделить, ни очистить вследствие огромной реакционной способности. Обычно определяютустойчивые молекулярные продукты реакций, в которых участвовалирадикалы. В настоящем обзоре мы не будем рассматривать ни методыопределения этих маркеров, ни методы, основанные на ингибированиипроцессов перехватчиками радикалов, например, такими какфенольные антиоксиданты (для радикалов гидроксила, липидов идругих органических молекул) или антиоксидантные ферменты(супероксиддисмутазадля САР и каталаза для H₂O₂) [29]. Эти методызачастую весьма эффективны, но не позволяют определять концентрациюили природу радикалов непосредственно.

Метод хемилюминесценции (ХЛ) обладает тем преимуществом, что, во-первых, он обычно не связан с изменением хода процессов в растворах, клетках или даже целых тканях, где регистрируется свечение, а во-вторых, весьма чувствителен при обнаружении именно высокореакционных радикалов.

Дело в том, что методом ХЛ непосредственно определяется не концентрациярадикалов, а скорость реакции, в которой они образуются. В самом общем случае реакция, в которой образование радикалов приводит к ХЛ, может быть представлена схемой:

Интенсивность свечения пропорциональна скорости последней реакции

I_CL= K⋅k_e[P*], (1)

Где K – коэффициент, который характеризует чувствительность прибора к излучению с данным квантовым выходом и спектром.

Из-за высокой скорости реакций превращения радикалов [R·], в системе мгновенно устанавливается стационарное состояние, при котором скорости всех последовательных реакций одинаковы. Отсюда ясно,что интенсивность ХЛ пропорциональна скорости образованиярадикалов v1

I_CL= K⋅k_e[P*] = K⋅v₁. (2)

При прочих равных условиях между скоростьюобразования радикалов и их стационарной концентрацией имеетсяпрямая зависимость, так как

I_CL= K⋅v1 = K⋅k₂[R·]. (3)

Таким образом, метод ХЛ отражает концентрацию радикалов всистеме, как и методы спектрофотометрии или ЭПР. Но в отличиеот ЭПР, показания хемилюминометра не зависят от того, какова реакционноспособностьрадикалов.

В нашей схеме эта величина определяется константой k₂ скоростиреакции исчезновения радикалов R·.

Стационарная концентрациярадикалов определяется уравнением:

K⋅v1 =K⋅k₂[R·], откуда [R·] = v₁ / k₂. (4)

Методом ЭПР (как и другими методами спектроскопии илифлуориметрии)определяется именно стационарная концентрациявещества, в нашем случае радикалов [R·]. При увеличении реактивностирадикалов, то есть с ростом k2 величина [R·] падает, а вместе с темуменьшается регистрируемый сигнал. Даже если активных радикаловобразуется много, их будет не видно из-за высоких значений k2. ИнтенсивностьХЛ, напротив, не зависит от реакционной способности радикалов,так как при увеличении реактивности радикалов одновременно ив той же мере снижается стационарная концентрация радикалов, ихпроизведение остается постоянным, а вместе с тем не происходит иизменения интенсивности ХЛ (уравнение 3). Иными словами, методХЛ регистрирует даже самые активные радикалы, концентрациякоторых в изучаемой системе может быть исчезающее мала, и вэтом – его уникальность и преимущество перед другими методамиобнаружениярадикалов в химических и биологических системах.Чем активнее радикал, тем труднее его непосредственно обнаружитьметодом ЭПР, но для ХЛ этого ограничения не существует.