Вопрос №7

Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при нагревании их растворов выше 50–60°С.Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры. При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы , включая биологическую активность. Таким образом, при денатурации белковая молекула полностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для практических целей иногда используют процесс денатурации в «мягких» условиях, например при получении ферментов или других биологически активных белковых препаратов в условиях низких температур в присутствии солей и при соответствующем значении рН . Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Обратимое осаждение.Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Вид обатим. Осаждения : Высаливание (дегидратация молекул белка).

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Свойства белковых растворов определяются большими размерами молекул, т.е. белки являются коллоидными частицами и образуют коллоидные растворы.

К свойствам белковых растворов относятся:

1. Рассеивание света вследствие дифракции на коллоидных частицах – опалесценция. Особенно это заметно при прохождении луча света через белковый раствор, когда виден светящийся конус (эффект Тиндаля).

2. Белковые растворы в отличие от истинных обладают малой скоростьюдиффузии.

3. Неспособностьбелковых частиц проникать через мембраны, поры которых меньше диаметра белков (полунепроницаемые мембраны). Это используется в диализе. Очистка белковых препаратов от посторонних примесей лежит в основе работы "искусственной почки" при лечении острой почечной недостаточности.

4. Создание онкотического давления, то есть перемещение воды в сторону более высокой концентрации белка, что проявляется, например, как формирование отеков при повышении проницаемости сосудистой стенки.

5. Высокая вязкость в результате сил сцепления между крупными молекулами, что проявляется, например, при образовании гелей и студней.

белки устойчивы в растворе, т.к. имеют заряд и гидратную оболочку. Они называются факторами устойчивости белка. Осадить белок из раствора можно, если удалить даже один из факторов устойчивости.

5.Ионизация белка и зависимость заряда от рН среды.Благодаря наличию в своем составе свободных амино- и карбоксильных групп белки являются полиэлектролитами (амфотерными электролитами). Белки в растворах находятся преимущественно в виде биполярных ионов (цвиттерионов, амфионов). При этом свободные карбоксильные группы белков оказываются диссоциированными (_{_}-СОО^-), а свободные аминогруппы оказываются протонироваными (-NН₃⁺). Таким образом, ионизация белков является следствием диссоциации свободных карбоксильных групп и протонирования свободных аминогрупп

В свою очередь степень ионизации (а значит и знак, и величина заряда) зависит от рН 

Значение рН, при котором число положительных зарядов равно числу отрицательных зарядов, называется изоэлектрической точкой данного белка. В растворах с рН ниже изоэлектрической точки белок приобретает положительный заряд, а выше ИЭТ отрицательный. В ИЭТ точке белки наиболее неустойчивы. Это может быть использовано для разделения белков. Белки с ИЭТ в области кислых значений рН характеризуются преобладанием кислых аминокислот ( ГЛУ и АСП ). ИЭТ белка выше 7 указывает на преобладание в составе белка основных аминокислот ( АРГ, ЛИЗ, ГИС).

Гидратация и растворимость белков. Большинство глобулярных белков относятся к гидрофильным веществам, хорошо растворяющимся в воде. Это свойство обусловлено расположенными на поверхности белка группами, способными гидратироваться. Под гидратацией понимается связывание диполей воды с ионными и полярными группами белка, такими как -СОО^` , -NН₃⁺, -СОNH₂ , -OH, -SH , в результате чего образуется гидратная оболочка белков (рис. 1.3). Благодаря этому каждая молекула белка покрывается несколькими молекулярными слоями воды, т.е. одна молекула белка отделена от другой слоем воды и находится в состоянии истинного раствора. Растворимость белков в воде возрастает при добавлении небольших количеств нейтральных солей (сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат магния). Небольшие концентрации солей увеличивают степень диссоциации ионизированных групп, экранируют заряженные группы белка и тем самым уменьшают белок-белковое взаимодействие. Высокие концентрации нейтральных солей, напротив, осаждают белки из водных растворов, т.к. при больших концентрациях соли оттягивают на себя от молекул белка молекулы воды, т.е. лишают белок его гидратной оболочки. Так как, степень диссоциации ионогенных групп белка определяет возможности гидратации белка они хуже растворяются при рН равной его изоэлектрической точке (ИЭТ).

Факторами стабилизации белков в растворе являются наличие заряда поверхности белковой молекулы, броуновское движение молекул. При добавлении в раствор белка органических растворителей вследствие уменьшения диэлектрической постоянной и уменьшения степени гидратации белков происходит их агрегация и выпадение в осадок.

Белковые растворы не являются типичными коллоидными растворами, т.к. белки диспергированы до единичных молекул и образуют гомогенный раствор. Сходство белковых и коллоидных растворов основано на том, что молекулы белков имеют размеры, приближающиеся к размеру мицелл коллоидного раствора. Растворы белков при определенных условиях могут терять текучесть и образовывать гели, возникающие в результате объединения молекул в виде сетки, внутреннее пространство которой заполнено растворителем. В виде гелей белки находятся в хрусталике глаза, гели образуются при сквашивании молока, при подготовке растений к зимнему периоду происходит переход части белков в гелеобразное состояние.

Вопрос №8

Взаимодействие белков с лигандами,как основа их функционирования.Понятие об активном центре белка .Особенности формирования активного центра .Специфичность связывания белка с лигандом . Принцип комплементарности . Две гипотезы соответствия структур активного цента и лиганда .

Есть условие для нормального функционирования белка ,чтобы присоединить к нему другое вещество-лиганд.Взаимодействие белка с лигандом высокоспецифично, что определяется строением участка белка, называемого центром связывания белка с лигандом или активным центром. Активный центр - определённый участок белковой молекулы, сформированный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способный комплементарно связываться с лигандом . В линейной последовательности полипептидной цепи радикалы, формирующие активный центр, могут находиться на значительном расстоянии друг от друга. Высокая специфичность связывания белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра белка структуре лиганда . Под комплементарностью понимают соответствие взаимодействующих молекул. Лиганд должен обладать способностью входить и совпадать с конформацией активного центра. Это совпадение может быть неполным, но благодаря конформационной лабильности белка активный центр способен к небольшим изменениям и "подгоняется" под лиганд. Кроме того, между функциональными группами лиганда и радикалами аминокислот, образующих активный центр, должны возникать связи, удерживающие лиганд в активном центре. Связи между лигандом и активным центром белка могут быть как нековалентными (ионными, водородными, гидрофобными), так и ковалентными. Уникальные свойства активного центра зависят не только от химических свойств формирующих его аминокислот, но и от их точной взаимной ориентации .Поэтому даже незначительные нарушения общей конформации белка в результате точечных изменений его первичной структуры или условий окружающей среды могут привести к изменению химических и функциональных свойств радикалов, формирующих активный центр, нарушать связывание белка с лигандом и его функцию. При денатурации активный центр белков разрушается, и происходит утрата их биологической активности. Гипотеза "ключ-замок":активный центр фермента комплементарен субстрату, т.е. соответствует ему как "ключ замку". После взаимодействия субстрата ("ключ") с активным центром ("замок") происходят химические превращения субстрата в продукт. Активный центр при этом рассматривался как стабильная, жёстко детерминированная структура. Гипотеза индуцированного соответствия: активный центр является гибкой структурой по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса, благоприятного для химических модификаций субстрата. При этом молекула субстрата также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции.