Полимеразная цепная реакция (пцр)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить вирус в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК или РНК вируса без выделения последнего в чистой культуре. Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного вируса гена. ПЦР основан на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют (“расплетают” при нагревании) и достраивают, при охлаждении, к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити, в результате чего из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких однонитевых ДНК, комплементарных 3’-концам ДНК искомого гена), ДНК-полимеразы и нуклеотидов. А в случае с РНК-содержащими вирусами на первом этапе осуществляется синтез ДНК на матрице геномной РНК (обратная транскрипция при участии фермента ревертазы), далее процесс амплификации (накопления) происходит по вышеописанной схеме.

Иммуноферментный анализ (ифа)

Иммуноферментный анализ является иммунологической реакцией. Она основана на добавлении специфических антител или антигенов в исследуемую среду (чаще всего исследуемая кровь) с последующим ферментативным определением концентрации среагировавших комплексов антиген-антитело. По концентрации образовавшегося комплекса можно судить об уровне определяемого соединения в исследуемой среде.

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа – процедура отмывки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наиболее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может производиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора – вошера или вручную, многоканальной пипеткой.

Лабораторная диагностика трихомоноза

Основным методом диагностики является микроскопическое исследование . В патологическом материале выявляют живые подвижные трихомонады. Для этого из полученного смыва или суспензии из взятых выделений готовят препарат по методу «раздавленной» или висячей» капли и микроскопируют при увеличении х280 или х400 при опущенном конденсоре. Среди клеточных элементов трихомонады различают по их форме (грушевидная, овальная), по величине (примерно равны ядру клетки плоского эпителия) и характерной подвижности - толчкообразное, поступательное и вращательное движение за счет жгутиков и ундулирующей мембраны.

Окраска метиленовым синим: Ядро темно – синие, а цитоплазма бледно – синяя , Хорошо видна пенистость цитоплазмы. Ядро расположено эксцентрично и имеет удлинённую форму, напоминающую косточку сливы.

Окраска по Граму: Ядра слегка фиолетовые, цитоплазма и жгутики – розовые.

Окраска по Романовскому – Гимзе: Контуры ядра четко очерчены , Ядро окрашивается в фиолетово – красный цвет, жгутики и осевая нить – в интенсивно красный , а цитоплазма приобретает голубой цвет.