Диференціальні ознаки патогенних хламідій

C. trachomatis	C. psittaci	C. pneumoniaе
1. Елементарні тільця мають сферичну форму 2. Включення хламідій в клітині компактні, вони синтезують гікоген, який виявляють йодною пробою   3. Сульфадіазин пригнічує розмноження хламідій в курячому ембріоні	1. Елементарні тільця мають сферичну форму 2. Мікроколонії в клітині менш компактні, хламідії розташовуються по всій цитоплазмі, глікоген відсутній 3. Сульфадіазин не пригнічує хламідій у курячому мішку ембріоні	1. Форма елементарних тілець грушоподібна 2. Мікроколнії в клітині менш компактні, хлімідії часто розташовуються по всій цитоплазмі, не синтезується глікоген 3. У курячому ембріоні ростуть погано, не чутливі до сульфадіазину

 

Бактеріологічний метод діагносики трахоми досить трудомісткий, дорогий і вимагає підготовки кваліфікованих спеціалістів. Він можливий лише в спеціалізованих лабораторіях.

Більші можливості дає застосування імуноферментного аналізу. За його допомогою виявляють ліпополісахаридні антигени хламідій, які взаємодіють із специфічними моноклональними антитілами. Чутливість методу - 90 %.

Ще більшу ефективність при діагностиці трахоми, як і інших хламідіозів, дає використання полімеразної ланцюгової реакції. Цей метод дає позитивні результати в 90-100 % випадків, в той час як культуральні дослідження - в 60-80 %, а пряма імунофлуоресценція - в 55-75 %.

Серологічна діагностика. Імуноферментний аналіз є високоспецифічним і доступним методом серологічної діагностики трахоми. При наявності специфічних хламідійних антигенів, адсорбованих на поверхні лунок полістиролових планшет, ІФА можна використовувати в будь-якій мікробіологічній лабораторії.

Реакція непрямої гемаглютинації також має високу чутливість. Вона проста за технікою постановки, але еритроцитарний хламідійний діагностикум може реагувати і з антитілами проти рикетсій Провачека. При тяжкій і середньої тяжкості формах захворювання РНГА випадає у високих титрах.

Реакція зв'язування комплементу практично майже не використовується, оскільки часто дає псевдопозитивні результати.

 

Орнітоз

 

Орнітоз (пситакоз) - гостра інфекційна хвороба птахів, тварин і людей, що спричиняється Chlamydia psittaci, характеризується розвитком пневмонії, грипо - або тифоподібної гарячки, м'язевих болей, рідше кореподібного висипу. Зараження людини частіше всього настає від птахів при вдиханні висушеного посліду, пуху, а також при розробці туш.

Мікробіологічна діагностика зводиться до виділення збудника з крові або харкотиння (1-й тиждень хвороби), виявлення наростання титру антитіл (2-4-й тиждень), постановки алергічної проби.

Бактеріологічне дослідження. Для виявлення хламідій у хворого беруть 8-10 мл крові в перші 2 тижні захворювання. З харкотиння збудника можна виділити до 25-го дня. Нативною кров'ю без попередньої її обробки заражають курячі ембріони в хоріоналантоїсну оболонку, порожнину алантоїсу або жовтковий мішок. Харкотиння перед введенням в ембріон обробляють антибіотиками. Заражені ембріони інкубують у термостаті при 35-36 ⁰С протягом 3-4-х діб. У мазках-відбитках з алантоїсної оболонки або в алантоїсній рідині виявляють елементарні тільця після забарвлення акридином оранжевим або за Романовським-Гімзою. При мікроскопуванні у цитоплазмі клітин видно спеціальні включення, які мають яскраво-зелене світіння. Азур-еозин забарвлює молоді хламідії у червоно-фіолетовий колір, а зрілі форми - у синьо-фіолетовий.

Досліджуваним матеріалом заражують також культури епітеліальних клітин первинних або перещеплюваних ліній різного походження: L-929, Hela, Hep-2, курячі фібробласти. Після культивування протягом 48 год у цитоплазмі клітин виявляють специфічні включення за описаними вище способами. Найкращим із них є метод ідентифікації за допомогою прямої імунофлуоресценції.

Біологічне дослідження. Для виявлення хламідій орнітозу використовують біологічний метод - досліджуваним матеріалом заражають інтрацеребрально, інтраназально або в черевну порожнину білих мишей-сисунків. Через 3-5 днів вони гинуть від пневмонії. При мікроскопічному дослідженні мазків-відбитків виявляють мікроколонії хлімідій в цитоплазмі мононуклеарних клітин.

Серологічне дослідження. Основним методом серологічної діагностики хвороби є постановка реакції зв'язування комплементу, гальмування гемаглютинації та ІФА зі стандартним орнітозним діагностикумом. Комплементзв'язуючі та й інші антитіла з'являються в крові хворих через 5-8 днів у невеликій кількості, потім їх титр наростає. Тому серологічні реакції краще ставити методом парних сироваток. Діагноз підтверджується при наростанні титру антитіл у 4 рази і більше. Хороші результати дає також реакція непрямої імунофлуоресценції.

Алергічна проба з орнітином (інактивована алантоїсна культура C. psittaci) ставиться як для ранньої (2-9-й день хвороби), так і ретроспективної діагностики. Облік реакції проводять через 24-48 год. Гіперемію та інфільтрат діаметром до 1 см розцінюють як слабкопозитивну реакцію, до 2 см - позитивну, більше 2 см - різко позитивну. Висока специфічність алергічної проби залежить від ступеня специфічності алергену, оскільки можуть бути перехресні реакції за рахунок групових хламідійних антигенів.

 

Респіраторний хламідіоз

 

Хламідійна пневмонія - інфекційна хвороба, яка характеризується запаленням легень, катаром верхніх дихальних шляхів, загальною інтоксикацією. Збудник - Chlamydiapneumoniae. Від інших хлімідій вона відрізняється грушоподібною формою елементарних тілець. Джерело інфекції - хворі люди. Збудник виділяється з носоглотки, механізм зараження - повітряно-крапельний.

У зв'язку з тим, що C.  pneumoniae погано розмножується в курячих ембріонах і культурах клітин методи бактеріологічної діагностики не використовуються. Практичні лабораторії не мають реагентів і для серологічної діагностики респіраторного хламідіозу. Для виявлення та ідентифікації хламідій пневмонії в досліджуваному матеріалі використовують лише реакцію імунофлуоресценції із застосуванням моноклональних антитіл до високоспецифічного антигена збудника.

 

Сечостатевий хламідіоз 

Патогенні хламідії, особливо C. trachomatis, досить часто викликають гострі або хронічні запалення уретри, вагіни, шийки матки. Урогенітальний хламідіоз впродовж останнього десятитиріччя зустрічається частіше, ніж сифіліс і гонорея. Основний шлях передачі захворювань - статевий, значно рідше - побутовий.

Матеріалом для лабораторного дослідження служать зскрібки зі слизової уретри у чоловіків і жінок та зскрібки із шийки матки у жінок. Український НДІ дерматології та венерології розробив уніфіковані методи діагностики сечостатевих хламідіозів. Серед них важливе значення мають експрес-методи, виявлення морфологічних структур та антигенів хламідій у досліджуваному матеріалі, виділення хламідій в культурах клітин, виявлення хламідійних антитіл за допомогою серологічних реакцій, молекулярно-біологічний метод та полімеразна ланцюгова реакція.

Експрес-методи. Ряд фірм США та Франції розробили спеціальні діагностичні тести для проведення імунохроматографічних експрес-методів, які можуть видати результат через 10-30 хв. Однак їх чутливість і специфічність значно менша ніж при проведенні повномасштабних досліджень.

Мікроскопічні методи. Досліджуваний матеріал беруть у хворих, які протягом місяця не повинні приймати антибіотики. Зскрібки роблять одноразовим зондом (щіточкою, ложечкою Фолькмана, жолобкуватим зондом). Інфекційний матеріал наносять на поверхню 8 мм ямки спеціального предметного скла. Мазок висушують 20-30 хв і фіксують у холодному ацетоні протягом  5-10 хв, забарвлюють за методом Романовського-Гімзи 35-40 хв, обробляють підкисленим етанолом (3-5 крапель льодяної оцтової кислоти на 15-20 мл спирту) протягом 5-10 с, промивають водою, висушують і мікроскопують. Ретикулярні тільця забарвлюються в синьо-фіолетовий колір, а елементарні тільця - в рожево-червоний. Зернистрі структури хламідій розміщуються поблизу ядра. Виявлення 5-10 типових включень має діагностичне значення.

Антигени хламідій в інфекційному матеріалі виявляють за допомогою прямої і непрямої реакції імунофлуоресценції. Суть прямого методу полягає у з'єднанні мічених флуорохромом антитіл із хламідійним антигеном і виявленні специфічного світіння  при люмінесцентній мікроскопії. Люмінуюча антихламідійна  сироватка виготовляється в Харкові. Є багато закордонних діагностичних систем для проведення цього методу.

Суть непрямого методу полягає у з'єднанні комплексу антиген + немічені хламідійні анттіла з видовою (антиглобуліновою) міченою флуоресцеїном сироваткою.

Окрім мікроскопічних методів антигени хламідій в інфекційному матеріалі можна виявити за допомогою імуноферментного аналізу. Принцип методу полягає у взаємодії моноклональних хламідійних антитіл, адсорбованих на твердій фазі, з антигеном хламідій, що знаходиться у досліджуваному матеріалі, й утворенні імунних комплексів. Матеріалом для аналізу можуть бути зскрібки зі слизових оболонок, центрифугати сечі, секрети, біоптати тощо.

Вже розроблено й впроваджено в практику багато діагностичних тест-систем для ІФА. Досліджуваний матеріал вносять на адсорбовані в лунках планшети антітіла. Оцінка результатів проводиться за допомогою імуноферментного аналізатора згідно з інструкцією до кожної тест-системи. Чутливість ІФА для виявлення хламідій коливається в межах 50-70 % у чоловіків і 88-100 % у жінок.

Виділення хлімідій в кульутрах клітин. Найбільш точним і доказовим методом діагностики хламідіозу є виділення збудника на культурі клітин (золотий стандарт). Найчастіше використовують культури клітин L-929, McСoy, Hela, BHK-21. У стерильні плоскодонні пробірки діаметром 14 мм вносять на дно покрівні скельця, додають по 1 мл клітинної суспензії в живильному середовищі (110⁵ клітин/мл) і ставлять на 24-48 год у термостат при 37 ⁰С для утворення моношару клітин на покрівних скельцях. Потім середовище виливають, вносять інфекційний матеріал, оброблений антибіотиками, центрифугований протягом години при 3000 об/хв, інкубують у термостаті 2 год при 37 ⁰С. Досліджуваний матеріал виливають, замінюють його свіжим живильним середовищем, інкубують у термостаті 48-72 год. Покрівні скельця з моношаром клітин виймають, фіксують 10 хв метанолом, промивають фосфатним буфером і забарвлють за методом Романовського-Гімзи. Покрівні скельця монтують на предметному склі моношаром клітин донизу в канадському бальзамі.

Під імерсійним об'єктивом виявляють наявність цитоплазматичних включень. Елементарні тільця хламідій забарвлюються у червоний, а ретикулярні тільця - у синій колір.

При обробці препаратів флуоресцентними антитілами моношар клітин також монтують на предметному склі в гліцерині й досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Метод високоспецифічний (100 %) і чутливий (75 %), але досить складний, дорогий, результат отримують через 72-96 год. Окрім того є великий ризик зараження персоналу. Для практичних лабораторій він ще малодоступний.

Імунологічна діагностика. У сучасній практиці серологічних досліджень сечостатевих хламідіозів використовують 4 імунологічні реакції: непрямої імунофлуоресценції, непрямої гемаглютинації, зв'язування комплементу та метод імуноферментного аналізу. Матеріалом для дослідження в усіх 4-ох реакціях є сироватка крові хворих, секрети статевих залоз.

З метою виявлення хламідійних антитіл у реакції непрямої імунофлуоресценції застосовують специфічний хламідійний антиген, який забезпечує реакції з антитілами до всіх варіантів C. trachomatis.

При постановці цієї реакції на предметному склі готують слайд-антигени. Скло вміщують на трафарет із зазначенням зон нанесення антигенів (контрольного і специфічного). Слайди висушують 15-20 хв і фіксують в охолодженому ацетоні. Потім на слайд-антигени наносять відповідні розведення сироватки, інкубують 40 хв при 37 ⁰С у вологій камері. Після цього препарат тричі промивають фосфатним буферним розчином, додають антивидову люмінуючу сироватку, ще раз витримують 40 хв у вологій камері й знову тричі промивають. Висушені слайди досліджують під люмінесцентним мікроскопом. Техніку постановки реакції виконують згідно інструкції, що додається до кожногої діагностичної тест-системи.

Оцінку результатів проводять за ступенем специфічної флуоресценції комплексів елементарних і ретикулярних тілець з антитілами, використовуючи класичну чотириплюсову систему. За титр хламідійних антитіл сироватки хворого приймають те найбільше її розведення, при якому спостерігається чітке яскраво-зелене світіння не менше, ніж на 2+. При хлімідійному ураженні сечостатевої системи він дорівнює 1:64 і вище.  Постановка РІФ методом парних сироваток повинна виявити наростання титру антитіл у 4 рази від початкового рівня.

Рекцію непрямої гемаглютинації використовують, в основному, для діагностики зоонозних хламідіозів і первинного серологічного скринингу захворювань у людей.

Реакція зв'язування комплементу дає змогу виявити антитіла до родоспецифічного антигену хламідій. Ставлять її за звичайною схемою. Діагноз вважають позитивним при титрі комплементзв'язуючих антитіл 1:64 і вище. РЗК мало підходить для діагностики хламідійних інфекцій генітальної системи.

Виявлення хламідійних антитіл імуноферментним методом основано на взаємодії антигена з хламідій на поверхні лунок полістирилових планшет з IgM і IgG у сироватках хворих людей. Уже виготовлена велика кількість діагностичних наборів.

Спочатку сироватку хворого розводять у допоміжному ряді пробірок, потім проводять сорбцію антитіл у лунках мікротитрувального планшета. Детальна методика постановки ІФА викладена в інструкції, що додається до діагностичної тест-системи. ІФА рекомендують ставити за допомогою парних сироваток. Оцінку результатів здійснюють за допомогою імуноферментного аналізатора за величиною оптичної щільності розчинів у лунках полістирилового планшета.