4.4. Способы и системы для создания анаэробных условий

Материал, забранный из соответствующих источников и в подходящие для этих целей контейнеры или транспортную среду, должен быть доставлен незамедлительно в лабораторию. Однако имеются сведения, что клинически значимые анаэробы в больших объемах гноя или в анаэробной транспортной среде выживают в течение 24 часов. Важно чтобы среда, в которую проведен посев, инкубировалась в анаэробных условиях или была помещена в заполненный СО₂ сосуд и сохранялась до момента переноса в специальную инкубационную систему. Имеется три типа анаэробных систем, широко используемых в клинических лабораториях. Более широко применяются системы микроанаэростатов типа (GasPark, BBL, Cockeysville), которые используются в лабораториях многие годы, особенно в малых лабораториях, и позволяют получить удовлетворительные результаты. Чашки Петри с посевом анаэробных бактерий помещаются внутрь сосуда одновременно со специальным пакетом, генерирующим газ, и индикатором. В пакет добавляется вода, сосуд герметически закрывается, из пакета в присутствии катализатора (обычно палладиевого) выделяется СО₂ и Н₂. В присутствии катализатора Н₂ реагирует с О₂ образуя воду. СО₂ необходим для роста анаэробов, так как они являются капнофилами. В качестве индикатора анаэробных условий добавляется метиленовый синий. Если газогенерирующая система и катализатор работают эффективно, то наблюдается обесцвечивание индикатора. Для большинства анаэробов необходимо культивирование не менее 48 часов. После этого камеру открывают и чашки иссле­дуют первично, что представляется не совсем удобным, так как анаэробы чувствительны к кислороду и быстро утрачивают жизнеспособность.

В последнее время в практику вошли более простые анаэробные системы - анаэробные мешки. В прозрачный, герметически закрываемый полиэтиленовый мешок помещают одну или две засеянных чашки с генерирующим газ пакетом и инкубируют в условиях термостата. Прозрачность полиэтиленовых мешков позволяет легко проводить периодидеский контроль за ростом микроорганизмов.

Третьей системой культивирования анаэробных микроорганизмов является автоматически герметизированная со стеклянной передней стенкой камера (анаэробная станция) с резиновыми перчатками и автоматической подачей безкислородной смеси газов (N₂ , H₂, СО₂). Материалы, чашки, пробирки, планшеты для биохимической идентификации и определения чувствительности к антибиотикам помешаются в этот кабинет через специальный люк. Все манипуляции выполняются бактериологом в резиновых перчатках. Материал и чашки в данной системе могут просматриваться ежедневно, а посевы могут инкубироваться от 7-10 дней.

Эти три системы имеют свои достоинства и недостатки, но они эф­фективны для выделения анаэробов и должны быть в каждой бактерио­логической лаборатории. Часто они используются одновременно, хотя наибольшая надежность принадлежит методу культивирования в анаэробной станции.

 

4.5. Питательные среды и культивирование

Исследование анаэробных микроорганизмов осуществляется в несколько этапов. Общая схема выделения и идентификации анаэробов представлена на рисунке 1.

Важным фактором развития анаэробной бактериологии является наличие коллекции типовых штаммов бактерий, включая референсштаммы из коллекций АТСС, CDC, VPI. Особенно это важно для контроля питательных сред, для биохимической идентификации чистых культур и оценки активности антибактериальных препаратов. Имеется широкий спектр основных сред, которые используются для приготовления специальных питательных сред для анаэробов.

Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребностям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адекватно редуцированными. Первичный посев материала осуществляется на чашки с кровяным агаром или элективные среды, приведенные в таблице 7.

Все чаще выделение облигатных анаэробов из клинического материала осуществляется на средах, которые включают селективные агенты в определенной концентрации, позволяющие выделить определенные группы анаэробов.

Таблица 3. Среды рекомендуемые для первичного выдыления анаэробов

№	Питательная среда	Назначение
1	Кровяной агар для бруцелл (CDC анаэробный кровяной агар, кровяной агар Шэдлера), (BRU agar)	Неселективная, для выделения анаэробов, присутствующих в материале
2	Желчно-эскулиновый агар для бактероидов (ВВЕ agar)	Селективная и дифференциальная; для выделения бактерий группы Bacteroides fragilis
3	Канамицин-ванкомицин кровяной агар (KVLB)	Селективная для большинства неспорообразующих грамотрицательных бактерий
4	Фенил-этиловый агар (PEA)	Ингибирует рост протея и других энтеробактерий; стимулирует рост грамположительных и грамотрицательных анаэробов
5	Тиогликолевый бульон (THIO)	Для специальных ситуаци
6	Желточный агар (EYA)	Для выделения клостридий
7	Циклосерин-цефокситин-фруктозный агар (CCFA) или циклосеринманнитовый агар (СМА) или циклосеринманнитовый кровяной агар (СМВА)	Селективная для С. difficile
8	Кристалл-виолет-эритромици-новый агар (СVЕВ)	Для выделения Fusobacterium nucleatum и Leptotrichia buccalis
9	Бактероид гингивалис агар (BGA)	Для выделения Porphyromonas gingivalis

Учет результатов осуществляют путем описания культуральных свойств выросших микроорганизмов, пигментации колоний, флуоресценции, гемолиза. Затем из колоний готовят мазок, окрашивают по Граму. В дальнейшем микроорганизмы каждого типа колоний пересевают и культивируют в тиогликолсевом бульоне с добавлением гемина и витамина К. Морфология колоний, присутствие пигмента, гемолитические свойства и характеристика бактерий при окраске по Граму позволяют предварительно определить и дифференцировать анаэробы. В результате чего все анаэробные микроорганизмы можно разделить на 4 группы: 1) Гр⁺ кокки; 2) Гр⁺ бациллы или коккобациллы: 3) Гр^- кокки; 4) Гр^- бациллы или коккобациллы.

На третьем этапе исследований проводят более длительную идентифика­цию. Конечная идентификация основывается на определении биохимических свойств, физиологических и генетических характеристик, факторов патогенности в тесте нейтрализации токсинов. Хотя полнота идентификации анаэробов может существенно варьировать, некоторые простые тесты с высокой вероятностью позволяют идентифицировать чистые культуры анаэробных бактерий - окраска по Граму, подвижность, определение чувствительности к некоторым антибиотикам методом бумажных дисков и биохимические свойства.