1.4. Флуоресцентная микроскопия

Этот метод световой микроскопии возник на основе ультрафиолетовой как ее модификация, предназначенная для исследования «холодного свечения» некоторых объектов под воздействием ультрафиолетовых лучей – люминесценции. Первый ультрафиолетовый микроскоп был сконструирован немецкими оптиками О. Гeймштадтом и Г. Леманом в 1911 г., а в 1913 г. фирма Zeiss начала выпуск люминесцентного микроскопа серийно.

Люминесценция (от латинского lumen — свет и -escent — слабое действие) отличается от других процессов с участием света отсутствием зависимости от температуры и длительностью, превышающей период излучаемой световой волны. По длительности свечения люминесценцию подразделяют на быстро затухающую флуоресценцию (время возбужденного состояния молекулы составляет 10^-11–10^-6 с) и относительно более продолжительную фосфоресценцию (время возбужденного состояния увеличено до 10^-3–10^-2 с). Природа люминесценции была раскрыта советским академиком С.И. Вавиловым. Он показал, что с позиций квантовой механики различия времени жизни люминесцирующих молекул объясняются энергетическими переходами возбужденных электронов.

Элементарные события процесса спонтанной флуоресценции иллюстрирует диаграмма Яблонского (рис. 1.19).

Из диаграммы следует, что в поглотившей фотон hν_A молекуле электрон переходит из основного состояния S₀ в возбуждённое состояние S₃, а затем опускается на энергетический уровень S₁ без излучения или возвращается в основное состояние S₀ с испусканием фотона hν_E. Рассеяние энергии при безызлучательном переходе S₂→S₁ приводит к двум последствиям:

Рис. 1.19. Диаграмма Яблонского: S₀ – основной энергетический уровень молекулы, S₁ – безызлучательный уровень возбужденного состояния, S₂ и S₃ – излучательные уровни возбужденного состояния (hν_A - поглощение фотона, hν_E - испускание фотона)

• энергия излученного фотона меньше энергии поглощенного фотона, и поэтому длина волны флуоресценции больше длины волны возбуждающего света;

• часть молекул в возбужденном состоянии не способна испускать фотоны при переходе в основное состояние, поскольку теряет энергию из-за нестабильности и взаимодействия с молекулами окружения.

Увеличение длины волны испускаемого света по сравнению с возбуждающим называется сдвигом Стокса. Другим важным параметром флуоресценции является квантовый выход, представляющий собой отношение числа излученных фотонов к числу поглощенных.

Представленный на диаграмме Яблонского процесс флуоресценции в реальных условиях цикличен, поскольку одна и та же молекула многократно поглощает и испускает фотоны. Поэтому для многоатомных молекул в растворе квантовые переходы S₀→S₂ или S₀→S₃ будут порождать непрерывный спектр возбуждения, а переход S₁→S₀ – непрерывный спектр испускания.

Собственная флуоресценция микрообъектов, или аутофлуоресценция, встречается редко. Из наиболее известных случаев следует отметить красное свечение хлорофилла в хлоропластах и голубое свечение стенок растительных клеток и бактерий при возбуждении ультрафиолетом. Широкое внедрение в биологию флуоресцентной микроскопии началось с применением флуоресцирующих красителей – флуорохромов, с помощью которых можно визуализировать субклеточные структуры. В качестве примера на рис. 1.23 показаны спектры возбуждения и испускания специфического для ДНК флуорохрома бромида этидия.

Рис. 1.20. Спектры поглощения и испускания специфического для ДНК флуорохрома бромида этидия (приведены к одинаковой амплитуде)

Следует отметить, что в разбавленных растворах спектр возбуждения флуорохромов совпадает со спектром поглощения. В связи с тем, что интенсивность флуоресценции значительно слабее возбуждающего света, в флуоресцентном микроскопе используются такие мощные источники света как ртутные или ксеноновые лампы и лазеры.

Современные флуоресцентные микроскопы изготавливают в соответствии со схемой, разработанной советскими оптиками Е.М. Брумбергом и Г.Н. Крыловой из Государственного оптического института.

Главным оптическим компонентом этой схемы (рис. 1.21) является набор из трех светофильтров (5, 6 и 9), который формирует т.н. «спектральный куб». Свет от источника 1 через коллектор 2, полевую диафрагму 3 и коллиматор 4 поступает на возбуждающий фильтр 5, который пропускает лучи только той длины волны, которая соответствует спектру поглощения флуорохрома. Далее установлено дихроическое зеркало - дифракционная решетка, которая отражает возбуждающий свет с короткой длиной волны, но пропускает флуоресценцию с увеличенной длиной волны. Дихроическое зеркало 6 отражает лучи через объектив 7 на препарат 8.

Рис. 1.21. Схема флуоресцентного микроскопа: 1 – источник света, 2 – коллектор, 3 – полевая диафрагма, 4 – коллиматор, 5 – возбуждающий фильтр, 6 – дихроическое зеркало, 7 – объектив, 8 – препарат, 9 – запирающий фильтр, 10 – тубусная линза

Возбужденная в препарате флуоресценция фокусируется объективом 7 обратно на дихроическое зеркало 6, которое теперь пропускает свет на запирающий фильтр 9, подавляющий остатки возбуждающего света. Далее тубусная линза 10 формирует изображение, которое можно наблюдать в окуляр или регистрировать с помощью цифрового фотоаппарата. Следует отметить, что в таком микроскопе объектив кроме основного назначения собирать лучи флуоресценции служит одновременно и конденсором для возбуждающего света.

Уже упоминавшийся специфический к ДНК флуорохром бромид этидия флуоресцирует красным светом при возбуждении ультрафиолетовым или зеленым. Поэтому для наблюдения его флуоресценции необходим спектральный куб из возбуждающего фильтра с полосой пропускания 510-560 нм, дихроического зеркала с порогом 580 нм и запирающего фильтра, который пропускает свет с длиной волны от 590 нм (рис. 1.22).

Рис. 1.22. Графики пропускания спектрального куба, предназначенного для наблюдения флуоресценции бромида этидия (набор фильтров №19 фирмы Zeiss)

Важным достижением клеточной биологии была разработка в 40 гг. XX века английским микробиологом А. Кунсом метода меченых антител. Этот метод сочетает распознавание молекул специфическими к ним антителами с последующей визуализацией образующихся комплексов с помощью флуоресцентного микроскопа. В качестве примера на рис. 1.23 приведены картины флуоресценции облученных рентгеновскими лучами клеток, которые были визуализированы специфическим к ДНК зондом DAPI (А), а также меченными флуорохромами антителами к двойным разрывам ДНК (Б) и молекулярному компоненту системы репарации Rad51 (В).

Рис. 1.23. Репарация двойных разрывов ДНК в культивируемых клетках человека после воздействия рентгеновскими лучами: А – распределение ДНК в ядре (флуорохром DAPI), Б - локализация двойных разрывов ДНК (антитела к гистону γ-H2AX, ), В – локализация сайтов репарации ДНК (антитела к белку Rad51)