1. Основы микроскопии
1.1 Принцип работы микроскопа
Глаз человека может различить две линии, которые видны под углом не менее чем в 1 минуту. Иначе говоря, если предмет находится на расстоянии около 250 мм (чтобы глазные мышцы слишком не напрягались), хорошо освещен и обладает высоким контрастом, можно наблюдать его детали размером 0,07-0,15 мм. Для того, чтобы увидеть объекты меньшего размера, необходимо воспользоваться оптическими приборами. Микроскопом называется такой оптический прибор, который предназначен для наблюдения близко расположенных объектов в увеличенном виде. Наиболее простым, однокомпонентным микроскопом можно считать штативную лупу (рис. 1.1А). Объект размещают в переднем фокусе лупы и наблюдают его увеличенное прямое мнимое изображение приблизительно на расстоянии наилучшего видения – 250 мм. Мнимым, или виртуальным, его называют потому, что оно строится зрительным анализатором человека как обратная проекция сходящихся лучей, представляя собой своего рода оптическую иллюзию, а не реально существующий физический объект. На сетчатку изображение проецируется в перевернутом виде, его истинное положение восстанавливается благодаря навыку, приобретаемому вскоре после рождения. Видимое увеличение лупы определяется как 250/f, где f – фокусное расстояние.
Максимальное увеличение лупы обычно не превышает 20 крат. Если требуется увеличение более 20х, необходимо использовать двухкомпонентный оптический прибор, или сложный микроскоп. В этом приборе первая линза, или объектив, дает увеличенное обратное действительное изображение в переднем фокусе окуляра, который формирует затем увеличенное прямое мнимое изображение как обычная лупа (рис. 1.1Б). Общее увеличение микроскопа будет:
Мобщее = Моб х Мок ,
где Моб - увеличение объектива, Мок - увеличение окуляра.
Расстояние от заднего фокуса объектива до переднего фокуса окуляра в двухкомпонентном микроскопе называется механической длиной тубуса. В старых микроскопах фирмы Zeiss длина тубуса была 160 мм, и поэтому увеличение объектива рассчитывалось как 160/fоб, где fоб – фокусное расстояние объектива. В настоящее время микроскопы конструируют в соответствии с трехкомпонентной схемой, которая предусматривает коррекцию объектива на бесконечность и применение дополнительной тубусной линзы (рис. 1.1В).
Рис. 1.1. Ход лучей в увеличительных оптических приборах: А – лупе, Б – микроскопе с конечной длиной тубуса, В – микроскопе с коррекцией объектива на бесконечность
В этом случае объектив имеет только передний фокус и выходящие из него лучи идут параллельно друг другу до тубусной линзы, которая собирает их в фокусе окуляра. Пространство между объективом и тубусной линзой может варьировать в широких пределах (до 150 мм), его используют для размещения дополнительных оптических элементов. Это решение упрощает конструкцию микроскопа и облегчает коррекцию оптических аберраций. Увеличение объектива рассчитывается для трехкомпонентной системы как fтл / fоб , где fтл – фокусное расстояние тубусной линзы (обычно 200 мм), fоб – фокусное расстояние объектива.
Объектив (отдельно или совместно с тубусной линзой) формирует промежуточное (первичное) изображение микрообъекта, которое окуляр увеличивает так, чтобы оно было видно глазом без особого напряжения, под углом 2-4 градуса. Из этого следует, что основным компонентом микроскопа является объектив, тогда как окуляр играет вспомогательную роль и в некоторых типах микроскопов, как например в проекционных фотомикроскопах, вообще может отсутствовать. В этом случае первичное изображение проецируется прямо на матрицу цифрового фотоаппарата.
С точки зрения современной физики световой микроскоп представляет собой быстродействующий аналоговый процессор. Оптика микроскопа мгновенно выполняет преобразования световых волн, проходящих через полупрозрачные биологические микрообъекты, в результате чего формируется их изображение, доступное для наблюдения человеком.
Природу физических явлений, лежащих в основе передачи объективом информации из микромира, объясняет дифракционная теория микроскопа, основы которой были заложены немецким физиком Эрнстом Аббе.
Свет представляет собой электромагнитное поле, электрический и магнитный векторы которого перпендикулярны как друг к другу, так и к направлению перемещения (рис. 1.2).
Рис. 1.2. Свет как электромагнитная волна: E – электрический вектор, B – магнитный вектор, х – направление распространения
Электрический и магнитный векторы пульсируют в световой волне синхронно, поэтому ее обычно представляют как одну синусоиду. Наиболее простые световые волны генерируются лазером. Эти волны отличаются тем, что имеют одинаковую длину и, соответственно, чистый цвет (это свойство обозначается как монохроматичность), они также распространяются синхронно, с постоянным фазовым сдвигом (это свойство называется когерентностью).
Монохроматическая и когерентная световая волна описывается уравнением:
,
где A амплитуда волны, T ее период, t время, x расстояние, v скорость света в данной среде.
Если вместо периода волны T (или частоты ее колебаний f = 1/T) ввести пространственную частоту u = 1/T и принять, что A = 1, t = 0 и в однородной среде ν = const, получим более простую форму уравнения:
Второе уравнение носит более общий характер, поскольку в него введена безразмерная пространственная частота u вместо частоты колебаний f (в Гц). В результате мы можем применить его и к неподвижной, «замороженной» световой волне, которая формирует волновой фронт, воспринимаемый нами как изображение.
Простейшая модель микроскопа может состоять из источника света и точечного круглого отверстия. Встретившись с отверстием, световая волна будет создавать узор Эри из центрального диска и серии концентрических колец (рис. 1.3). На центральный диск приходится 83.4% энергии волны, на первое кольцо – 7.2%, второе – 2.8%, третье – 1.4%, четвертое – 0.9% и на все остальные – 3.9%. Узор Эри представляет собой дифракционную картину, которая создается в результате интерференции световых волн, приходящих от точечного источника света (аналогично свету звезды, наблюдаемой в сильный телескоп).
Рис.1.3.Круглое отверстие f(x), его дифракционная картина F(u) и перевод этой дифракционной картины в изображение круглого отверстия f(x)`
Дифракция световой волны на круглом отверстии математически может быть аппроксимирована прямым преобразованием Фурье:
где F(u) – дифракционная картина, f(x) – исходное изображение, x – пространственная координата, u – пространственная частота, i – мнимая единица.
Как следует из этого уравнения, дифракционная картина, или Фурье-образ, состоит из действительной и мнимой частей. При компьютерной обработке при помощи алгоритмов быстрого преобразования Фурье (БПП) используется обычно только действительная часть, которая интерпретируется как энергический спектр изображения.
Если в том месте, где формируется дифракционная картина, установить собирающую линзу, то в результате дальнейшей интерференции световых волн появится изображение исходного отверстия. Это означает, что из дифракционной картины F(u) можно восстановить изображение отверстия f(x), выполнив обратное преобразование Фурье:
При исследовании цитологического препарата в микроскопе дифракционная картина гораздо сложнее. Тем не менее, она также создается путем дифракции света на микроструктурах, размеры которых сопоставимы с длиной его волны. Линзы объектива преобразуют затем полученную дифракционную картину в изображение, доступное глазу человека. На рис. 1.4 видно, что дифракционная картина микрофотографии делящейся митозом клетки состоит из четырех квадрантов, причем противоположные квадранты зеркально симметричны по отношению друг к другу. Как и в случае узора Эри, основная энергия локализована в центре, она пропорциональна яркости исходного изображения. Более яркая область вокруг центра представлена низкими и средними пространственными частотами, в которых содержится информация о структуре исходного изображения, тогда как на периферии в области высоких частот преобладает случайный шум. Такая дифракционная картина носит название OTF (Optical Transfer Funcion, функция оптической передачи). Функция оптической передачи контрастного цитологического препарата позволяет оценить реальную разрешающую способность объектива.
Рис. 1.4. Микрофотография анафазы митоза корешка лука f(x) и полученная с помощью прямого преобразования Фурье действительная часть его дифракционной картины F(u), которая обозначается как функция оптической передачи - OTF
Для микроскопии наиболее важным свойством преобразования Фурье является закон масштаба, который гласит, что чем меньше размеры микрообъекта, тем больше его дифракционная картина. Таким образом, при встрече световой волны и микрообъекта выполняется прямое преобразование Фурье, которое и обеспечивает увеличение микроскопа, тогда как объектив лишь выполняет обратное преобразование Фурье для того, чтобы человек мог распознать знакомые ему объекты. Недавно было показано, что можно вообще отказаться от оптики и регистрировать дифракционную картину телекамерой, а обратное преобразование Фурье выполнять на компьютере (Rodenberg J., Maiden A., 2010).
Качество изображения в микроскопе зависит от выполнения ряда условий. Прежде всего, испускаемый источником свет должен обладать когерентностью как необходимым условием интерференции волн при формировании дифракционной картины. Аббе, вероятно, был первым, кто понял, что качество изображения в микроскопе зависит от степени когерентности формирующих его световых волн.
Второе условие получения микроскопического изображения высокого качества также было сформулировано Аббе: объектив должен передавать как можно больше пространственных частот дифракционной картины. Поэтому в примере с круглым отверстием качество его изображения будет определяться количеством охваченных линзой дифракционных колец.
Основной характеристикой объектива является его разрешающая способность, которая согласно лорду Рэйли равна минимальному расстоянию между двумя точками, пока они еще видны раздельно. Он установил, что для раздельного наблюдения двух светящихся точек необходимо, чтобы интенсивность интервала между ними была, по крайней мере, на 20% меньше интенсивности самих точек, а для этого центральный максимум дифракционной картины одной точки должен попадать в первый минимум дифракционной картины другой точки (рис.1.5).
Рис. 1.5. Критерий оптического разрешения по Рэлею: A и B – дифракционные картины двух точек, d – минимальное расстояние между их центрами перед слиянием
Разрешающая способность объектива микроскопа выражается формулой Аббе:
d = 0.61 λ / n sinθ,
где d – минимальное расстояние между двумя точками (в нм), 0.61 – коэффициент, отражающий степень когерентности света (варьирует от 0.5 при полной когерентности до 0.84 при некогерентном освещении), λ – длина световой волны (в нм), n – показатель преломления среды, θ – половина угла раскрытия объектива.
Знаменатель этой формулы представляет собой показатель разрешающей способности объектива, он называется численной апертурой (Numerical Aperture или NA). Теоретически для сухих объективов максимальное значение численной апертуры может приближаться к 1, но в действительности оно достигает у лучших объективов 0.95 (рис. 1.6).
Рис.1.6. Разрешающая способность объектива определяется его численной апертурой, которая пропорциональна диаметру фронтальной линзы и углу раскрытия объектива (θ – половина этого угла).
Формула Аббе показывает, что разрешающая способность объектива будет тем выше, чем меньше длина волны света, чем больше плотность среды, в которой он распространяется, и чем больше численная апертура объектива.
Один из возможных способов увеличения разрешающей способности микроскопа состоит в применении жидких прозрачных сред с показателем преломления выше 1 – воды (n=1.33), глицерина (n=1.46), иммерсионного масла (n=1.51) и других. Для иммерсионных объективов численная апертура может достигать максимальной величины 1.4.
Чтобы воспользоваться высокой разрешающей способностью иммерсионных объективов, необходимо увеличить когерентность волн, поступающих из системы освещения. Для решения этой задачи Аббе разработал конденсор – оптическое устройство в виде перевернутого объектива, которое устанавливается перед препаратом и согласует апертуру объектива с апертурой источника света.
Для учета влияния конденсора на разрешение микроскопа формулу Аббе нужно представить в следующем виде:
d = 1.22 λ /(NAоб + NAкон),
где d – разрешение микроскопа (в нм), λ – длина световой волны (в нм), NAоб – численная апертура объектива, NAкон – численная апертура конденсора.
Из этой формулы следует, что численная апертура конденсора не менее важна для разрешения микроскопа, чем численная апертура объектива. Чтобы рассчитать разрешающую способность объектива среднюю длину волны белого света принимают равной 546 нм. В итоге, используя формулу Аббе, для сухого объектива с апертурой 0.95 без конденсора получим разрешение 350 нм, тогда как для объектива с масляной иммерсией и численными апертурами объектива и конденсора по 1.4 разрешение будет 240 нм. Таким образом, применение иммерсии и конденсора позволяет заметно поднять разрешающую способность микроскопа.
Увеличение при этом играет второстепенную роль. Максимальное полезное увеличение микроскопа составляет 1000*NA объектива и, следовательно, для самых лучших по разрешению объективов не превышает 1400х. Увеличение выше этого предела, создаваемое оптическим или электронным способом, называется бесполезным, поскольку не позволяет получить дополнительные детали в изображении.