1.Аминокислоты, классификация и строение протеиногенных кислот. Зависимость заряда аминокистот от рН среды. Изоэлектрическая точка. Характеристика пептидной связию. Первичная структура белков, методы определения. Зависимость биологических свойств белков от первичной структуры. Видовая специфичность первичной структуры белков.

Аминокислоты – это строительные блоки макромолекул – белков. По строению

они являются органическими карбоновыми кислотами, у которых, как минимум, один

атом водорода замещен на аминогруппу.

К Л А С С И Ф И К А Ц И Я

1. По абсолютной конфигурации молекулы – D- и L-формы. Различия связаны со взаимным

расположением четырех замещающих групп, находящихся в вершинах воображаемого тетраэдра.

В белке любого организма содержится только один изомер, для млекопитающих это L-аминокислоты. Однако оптические изомеры претерпевают самопроизвольную неферментативную рацемизацию, т.е. L-форма переходит в D-форму. Это обстоятельство используется для

определения возраста ткани.

2. В зависимости от положения аминогруппы

Выделяют α, β, γ и другие аминокислоты.

3. По оптической активности – право- и левовращающие.

Наличие ассиметричного атома С (хирального центра) делает возможным только два расположения химических групп вокруг него. Это приводит к особому отличию веществ друг от друга, а именно – изменению направления вращения плоскости поляризации поляризованного света, проходящего через раствор. В соответствии с углом поворота выделяют правовращающие (+) и левовращающие (–) изомеры. Деление на L- и D-формы не соответствует делению на право- и левовращаю-

щие. Для одних аминокислот L-формы (или D-формы) являются правовращающими,

для других – левовращающими. При смешивании L- и D-форм одной аминокислоты образуется рацемическая смесь, не обладающая оптической активностью.

4. по участию аминокислот в синтезе белков: протеиногенные (20 АК) и непротеиногенные (около 40 АК).

Протеиногенные аминокислоты подразделяют:

• По строению бокового радикала – неполярные (алифатические, ароматические) и полярные (незаряженные, отрицательно и положительно заряженные);

• По кислотно-основным свойствам – электрохимическая. Подразделяют нейтральные (большинство), кислые (Асп, Глу) и основные (Лиз, Арг, Гис) аминокислоты.

• По необходимости для организма (физиологическая классификация) – незаменимые (Лей, Иле, Вал, Фен, Три, Тре, Лиз, Мет) и заменимые. Две аминокислоты являются условно незаменимыми (Арг. Гис)

Являются амфотерными электролитами. Аминокислоты сочетают в себе свойства и кислот и оснований. Соответственно, в водном растворе аминокислоты ведут себя как кислоты – доноры протонов и как основания – акцепторы протонов.

Если общий заряд аминокислоты равен 0, то это ее состояние называют изоэлектрическим. Величина рН, при которой заряд аминокислоты равен 0, называется изоэлектрической точкой (pI).

• рI большинства аминокислот располагается в диапазоне рН от 5,5 (Фен) до 6,3 (Про).

• рI кислых аминокислот – рIГлу 3,2, рIАсп 2,8

• рI основных аминокислот – рIГис 7,6, рIАрг 10,8, рIЛиз 9,7

рI гистидина позволяет ему использоваться в буферной системе гемоглобина, в котором он содержится в большом количестве. Гемоглобин легко принимает и легко отдает протоны водорода при малейших сдвигах физиологической рН крови ( в норме 7,35-7,45).

Заряд аминокислот зависит от величины рН среды.

О тправным пунктом для понимания причин появления заряда у аминокислот является величина изоэлектрической точки. Ситуация различается для нейтральных, кислых и основных аминокислот.

Для нейтральных аминокислот:

Для кислых аминокислот:

Для основных аминокислот:

Пептидная связь — это связь между α-карбоксильной группой одной аминокислоты и α-аминогруппой другой аминокислоты.

1. Копланарность

Все атомы, входящие в пептидную группу находятся в одной плоскости, при этом атомы Н и О расположены по разные стороны от пептидной связи.

2. Транс-положение заместителей (радикалов) аминокислот по отношению к C-N связи.

3. Наличие кето- и енольной форм.

4. Способность к образованию двух водородных связей с другими группами.

5. Пептидная связь имеет частично характер двойной связи.

В результате она является жесткой структурой и вращение вокруг нее затруднено. Но, благодаря тому, что кроме пептидной в белке есть и другие связи, цепочка аминокислот способна вращаться вокруг основной оси, что придает белкам различную конформацию (пространственное расположение атомов).

Первичная структура.

Это последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Учитывая, что в синтезе белов принимает участие 20 аминокислот можно сказать о невообразимом количестве возможных белков.

20 аминокислот – 1018 различных пептидов длиной всего 20 аминокислот (при условии, что каждая аминокислота используется только один раз). У человека обнаружено около 100 тысяч различных белков.

Первичная структура белков задается последовательностью нуклеотидов в ДНК. Выпадение, вставка, замена нуклеотида приводит к изменению аминокислотного состава и, следовательно, структуры синтезируемого белка.

Например, при серповидно-клеточной анемии в 6 положении b-цепи гемоглобина происходит замена Глу на Вал. Это приводит к синтезу Hb S - такого гемоглобина.

Если изменение последовательности аминокислот носит не летальный характер, а приспособительный или хотя бы нейтральный, то такой белок может передаться по наследству и остаться в популяции. В результате возникают новые белки и новые качества организма, такое явление называется полиморфизм.

Например, возникновение групп крови АВ0 связано с тремя вариантами белка, осуществляющего присоединение к олигосахариду мембран эритроцитов либо N-ацетилгалактозы (группа А), либо

галактозы (группа В), либо белок вообще не имеет ферментативной активности (группа 0).

Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре опре-

деляет формирование вторичной, третичной и четвертичной структур.

2.Конформация пептидных цепей (вторичная и третичная структуры). Дисульфидные, водородные, гидрофобные и ионные связи в стабилизации конформации белковой молекулы. Супервторичная структура белков. Четвертичная структура белков. Кооперативные изменения конформации протомеров при функционировании белков. Возможность адаптивной регуляции биологической функции олигомерных белков с помощью аллостерических лигандов. Доменная структура белков. Функционирование белков. Комплементарность центра связывания белков структуре лиганда.

Белки - полимерные молекулы, в которых мономерами служат аминокислоты. В составе белков в организме человека встречают только 20 α-аминокислот.

Общая структурная особенность аминокислот - наличие амино- и карбоксильной групп, соединённых с одним и тем же α-углеродным атомом.

α-Аминокислоты могут ковалентно связываться друг с другом с помощью пептидных связей. Пептидная связь образуется между α-карбоксильной группой одной аминокислоты и α-аминогруппой другой, т.е. является амидной связью. При этом происходит отщепление молекулы воды

Первичная структура белка определяется:

1. Природой входящих в молекулу аминокислот.

2. Относительным количеством каждой аминокислоты.

3. Строго определенной последовательностью аминокислот в полипептидной цепи.

2. Вторичная структура

α-Спираль - жёсткая структура, имеет вид стержня. Внутреннюю часть этого стержня создаёт туго закрученный пептидный остов, радикалы аминокислот направлены наружу. β-Структура образует фигуру, подобную листу,сложенному «гармошкой», - β-складчатый слой В данном типе структуры пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп, входящих в состав пептидных групп через 4 аминокислотных остатка. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали (рис. 1-5). На один виток ?-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате ?-спираль "стягивается" множеством водородных связей. Несмотря на то, что данные связи относят к разряду слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность ?-спирали. Так как все гидрофильные группы пептидного остова обычно участвуют в образовании водородных связей, гидрофильность (т.е. способность образовывать водородные связи с водой) ?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.

 Супервторичная структура белков. В разных по первичной структуре и функциям белках иногда выявляются сходные сочетания и взаиморасположение вторичных структур, которые называются супервторичной структурой. Она занимает промежуточное положение между вторичной и третичной структурами. Супервторичные структуры имеют специфические названия, такие как «α-спираль-поворот-а-спираль», «лейциновая застежка молния», «цинковые пальцы» и др. Такие супервторичные структуры характерны для ДНК-связывающих белков.

« Лейциновая застежка-молния». Этот вид супервторичной структуры используется для соединения двух белков. На поверхности взаимодействующих белков имеются α-спиральные участки, содержащие не менее четырех остатков лейцина. Лейциновые остатки в α-спирали располагаются через шесть аминокислот один от другого. Так как каждый виток α-спирали содержит 3,6 аминокислотных остатка, радикалы лейцина находятся на поверхности каждого второго витка. Лейциновые остатки α-спирали одного белка могут взаимодействовать с лейциновыми остатками другого белка (гидрофобные взаимодействия), соединяя их вместе Гистоны - ядерные белки, в состав которых входит большое количество положительно заряженных аминокислот - аргинина и лизина (до 80%). Молекулы гистонов объединяются в олигомерные комплексы, содержащие восемь мономеров с помощью «лейциновых застежек», несмотря на значительный одноименный заряд этих молекул.

Цинковый палец» - вариант супервторичной структуры, характерный для ДНК-связывающих белков

Четвертичная структура белка - размещение в пространстве взаимодействующих между собой субъединиц, образованных отдельными полипептидными цепями белка. Белки, обладающие четвертичной структурой, называют также олигомерными белками, а полипептидные цепи, входящие в их состав, - субъединицами или протомерами. В некоторых белках такие субъединицы одинаковы или имеют сходное строение, а другие белки состоят из субъединиц с цепями разных типов.

Каждый из протомеров синтезируется в виде отдельной полипептидной цепи, которая сворачивается в глобулу и затем объединяется с другими путём самосборки. Каждая субъединица содержит участки, способные взаимодействовать с соответствующими участками других субъединиц. Эти взаимодействия осуществляются посредством водородных, ионных и гидрофобных связей между радикалами аминокислот, входящих в состав разных цепей.

2. Третичная структура белковТретичная структура белков - трёхмерная пространственная структура, образующаяся за счёт взаимодействий между радикалами аминокислот, которые могут располагаться на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной цепи.Связи, участвующие в формировании третичной структуры белковГидрофобные взаимодействия.При укладке полипептидная цепь белка стремится принять энергетически выгодную форму, характеризующуюся минимумом свободной энергии. Поэтому гидрофобные радикалы аминокислот стремятся к объединению внутри глобулярной структуры растворимых в воде белков. Между ними возникают так называемыегидрофобные взаимодействия, а также силы ван дер Ваальса между близко прилегающими друг к другу атомами. В результате внутри белковой глобулы формируется гидрофобное ядро. Гидрофильные группы пептидного остова при формировании вторичной структуры образуют множество водородных связей, благодаря чему исключается связывание с ними воды и разрушение внутренней, плотной структуры белка.Ионные и водородные связиГидрофильные радикалы аминокислот стремятся образовать водородные связи с водой и поэтому в основном располагаются на поверхности белковой молекулы.Все гидрофильные группы радикалов аминокислот, оказавшиеся внутри гидрофобного ядра, взаимодействуют друг с другом с помощью ионных и водородных связей.

Кооперативные изменения конформации протомеров при функционировании белков

Олигомерные белки обладают особыми свойствами, которых нету белков, не имеющих четвертичной структуры. Это можно увидеть, сравнивая белок мышц ми-оглобин и белок эритроцитов гемоглобин. Вторичная и третичная структуры ми-оглобина и протомеров гемоглобина очень сходны. Оба эти белка являются гемопротеинами и выполняют в организме сходные функции, в основе которых лежит способность обратимо связывать кислород.Простетическая группа этих белков — гем — представляет собой плоскую молекулу, содержащую четыре пиррольных цикла и соединенный с ними атом железа. Пептидная цепь миоглобина содержит 153 аминокислотных остатка. Из них примерно три четверти образуют восемь ос-спиральных участков, обозначаемых латинскими буквами от А до Н. Плоская молекула гема расположена в углублении между спиралями Е и F. Гем соединяется с белковой частью (глобином) гидрофобными связями между пирроль-ными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. Атом железа в молекуле гема образует шесть координационных связей: четыре с атомами азота пиррольных колец гема, одну с атомом азота имидазольного кольца гистидина, расположенного в спирали F (проксимальный гистидин), и еще одну — с молекулой 02. Спираль Е содержит также остаток гистидина, не связанный с гемом (дистальный гистидин), но способствующий присоединению кислорода к иону железа. Пиррольные кольца гема расположены в одной плоскости, в то время как атом железа в дезоксигемоглобине несколько выступает из этой плоскости (на0,6 ангстрема). Присоединение кислорода «выпрямляет» молекулу гема: железо перемещается в плоскость пиррольных колец. Поскольку железо связано с остатком проксимального гистидина пептидной цепи, то происходит и перемещение участка пептидной цепи, разрыв некоторых слабых связей в молекуле белка, т. е. несколько изменяется конформация белка. Таким образом, присоединение кислорода сопровождается изменением пространственной структуры. В этом отношении миоглобин и гемоглобин одинаковы, но следствия изменения их конформации различны.

Если в состав белков входят разные протомеры, то на них могут формироваться отличающиеся по структуре центры связывания с разными лигандами. При связывании лиганда с активным центром проявляется функция данного белка. Центр, расположенный на другом протомере, называется аллостерическим (другим, отличным от активного). Связываясь с аллостерическим лигандом или эффектором, он выполняет регуляторную функцию (рис. 1.18). Взаимодействие аллостерического центра с эффектором вызывает конформационные изменения в структуре всего олигомерного белка благодаря его конформационной лабильности. Это влияет на сродство активного центра к специфическому лиганду и регулирует функцию данного белка. Изменение конформации и функции всех протомеров при взаимодействии олигомерного белка хотя бы с одним лигандом носит название кооперативных изменений конформации. Эффекторы, усиливающие функцию белка, называются активаторами, а эффекторы, угнетающие его функцию, - ингибиторами. Если полипептидная цепь белка содержит более 200 аминокислот, как правило, её пространственная структура сформирована в виде двух или более доменов. Домен - участок полипептидной цепи, который в процессе формирования пространственной структуры приобрёл независимо от других участков той же цепи кон-формацию глобулярного белка. Так, лёгкая цепь иммуноглобулина G состоит из двух доменов. В некоторых случаях доменами называют отдельные структурные участки полипептидной цепи. Основным свойством белка, обеспечивающим его функцию, является избирательное взаимодействие с определенным веществом - лигандом. Лигандами могут быть вещества разной природы, как низкомолекулярные соединения, так и макромолекулы, в том числе и белки. На белковых молекулах есть участки, к которым присоединяется лиганд - центры связывания или активные центры. Центры связывания формируются из аминокислотных остатков, сближенных в результате формирования вторичной и третичной структуры. Связи между белком и лигандом могут быть нековалентными и ковалентными. Высокая специфичность взаимодействия («узнавания») белка и лиганда обеспечивается комплементарностью структуры центра связывания пространственной структуре лиганда. Под комплементарностью понимают химическое и пространственное соответствие активного центра белка и лиганда.

Kдисс.= [P]x[L]/[PL]. Здесь Кдисс. представляет собой константу диссоциации комплекса. Из уравнения равновесия реакции следует, что если [P] = [PL], то Кдисс.=[L]. Равенство [P] и [PL] наступает при полунасыщении белка лигандом, т.е. 50% молекул белка связаны с лигандом; а 50% свободны. Значит, Кдисс. равна такой концентрации L, при которой достигается насыщение белка на 50%. Изменение концентрации PL при постоянной концентрации Р и возрастающей концентрации L описывается гиперболической кривой. Максимальная величина PL означает, что весь белок связан с лигандом (кривая насыщения):

График насыщения белка лигандом

По кривой насыщения можно определить Кдисс. и, следовательно, оценить сродство лиганда к белку. Чем меньше Кдисс., тем больше сродство L и P.

3.Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию.Механизм денатурации.Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицине. Роль шаперонов в предотвращении денатурации белков. Ренативация белков.

. Гидрофобные взаим-ия, а так же ионные и водородные связи относятся к чису слабых. Поддержание конформации возможно благодаря возникновению множ слабых связей между участками полипептид цепи. Белки сост из огромного числа атомов, наход в постоянном движении, что приводит к небольшим перемещениям отдельных участков полипептид цепи, кот обычно не наруш общую структуру белка и его ф-ции. Т.е. белки облад конформационнойц лабильностью – склонностью к небольшим изменениям конформации за счёт разрыва одних и образ других слаб связей. Конформ белка может меняться при изменении хим и физич св-в среды, а так же при взаимодействии белка с др молекулами, что играет огромную роль в функц белка в живой клетке. Разрыв большого колич слаб связей в молекуле белка приводит к разрушению её нативной информации. Так как разрыв связей ностит случ хар-р, то молекулы одного индивид. белка преобретают в р-ре форму случайно сформир беспорядочных клубков, отличающихся друг от друга трёхмерной стр-рой. Потеря нативной инф сопровождается утратой специфич ф-и белков. Этот наз денатурация. При денатурации белков не происходит разрыва пептид связей, т.е. первич стр-ра не нарушается. Ф-ры, выз денатурацию: -выс температура >50гр увеличивающая тепловое движение атомов в молекуле и приводящая к разрыву слабых связей;, -интенсив встряхивание р-ра, приводящее к соприкосновению белковых молекул с воздуш средой на пов раздела фаз и изменению конф этих молекул, - орг в-ва способны взаимодейств с функц группами белков, что приводит к их конформационным изменениям, - кисл и щёлочи, - соли тяж металлов образ прочные связи с важными функц группами белков, - гетергенты (мыло) – в-ва, содерж гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функц группу. Шапероны – белки, способные связываться с белками, находящимся в неустойчивом состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию. Шапероны, участвующие в защите клет. белков от денатурирующих воздействий относятся к белкам светового шока(БТШ).При действии различных стрессовых факторов в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков они могут препятствовать их полной денатурации ивосстанавливать нативную инфу белков.Денатурация белков - это разрушение их нативной конформации под действием денатурирующих агентов, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственную структуру белка. Денатурация сопровождается разрушением уникальной трехмерной структуры и активного центра белка и потерей его биологической активности

При денатурации первичная структура белков остается неизменной.

Для денатурированных белков характерно:

• изменение конформации молекулы;

• уменьшение растворимости в воде;

• изменение заряда молекулы;

• меньшая устойчивость к действию протеолитических ферментов;

• потеря биологической активности.

. Во всех известных организмах от прокариотов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформа-цию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название «шапероны

Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны относят к «белкам теплового шока», быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям.

Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицинеВ биохимических исследованиях перед определением в биологическом материале низкомолекулярных соединений из раствора обычно удаляют белки. Для этой цели чаще всего используют трихлоруксусную кислоту. После её добавления в раствор денатурированные белки выпадают в осадок и легко удаляются фильтрованием. Трихлоруксусную кислоту можно также использовать для денатурации ферментов в целях прекращения ферментативной реакции.

В медицине денатурирующие агенты часто используют для стерилизации медицинских инструментов и материала, а также в качестве антисептиков. Например, в автоклавах при высокой температуре стерилизуют медицинские инструменты и материалы.

Фенол и его производные (крезол, резорцин) относят к известным антисептикам ароматического ряда. Обладающие высокой гидрофобностью, они эффективно действуют на вегетативные формы бактерий и грибы, вызывая денатурацию их белков. Эффективность антисептических свойств уменьшается с увеличением растворимости препарата в воде.

Раствор крезола в калийном мыле известен как препарат лизол, применяемый в качестве дезинфицирующего средства.

Берёзовый дёготь - одна из основных составных частей мази Вишневского, содержит в своем составе фенол. Препарат, используемый

для лечения ран, обладает высоким антимикробным действием.

Значительное количество антисептиков представлено солями тяжёлых металлов. Их антимикробное действие связано с тем, что уже в довольно низких концентрациях они взаимодействуют с белками микроорганизмов, блокируют их SH-группы и изменяют их конформацию. Из-за высокой токсичности большинство лекарств, содержащих соли тяжёлых металлов, применяют в качестве поверхностных антисептиков.

Так, высокой антимикробной активностью обладает сулема - дихлорид ртути (HgCl₂). Её используют для обработки рук и дезинфекции помещений. Случайное или преднамеренное отравление препаратами ртути вызывает тяжёлые некротические поражения слизистой оболочки пищеварительного тракта и некротические изменения в почках. Антимикробными свойствами обладают и препараты серебра, такие как ляпис (AgNO₃), колларгол (серебро коллоидальное), применяемые для обработки слизистых оболочек при инфекционных заболеваниях.

4.Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, размеры и форма белковой молекулы, растворимость. Факторы стабилизации белковых растворов. Механизм возникновения электрического заряда белков, зависимость от рН. Изоэлектрическая точка белка.Изоэлектрическая точка белка- значение рН в котором заряд = 0.

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом иоле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Растворы белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского-Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и последние появляются в моче.

1. Различия белков по форме молекул

Как уя£е говорилось выше, по форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).

2. Различия белков по молекулярной массе

Белки - высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).

3. Суммарный заряд белков

Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полилептидных цепей имеются а-амино- и а-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис.

4. Соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нативных молекул белков

На поверхности большинства внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.

5. Растворимость белковРастворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок.

5. Методы выделения индивидуальных белков: избирательное осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.

Гель-фильтрация - метод, основанный на различной способности молекул разных размеров проходить через своеобразные «молекулярные сита» - сефадексы - инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Крупные белковые молекулы не способны диффундировать внутрь гранул сефадекса и элюируются (выходят из колонки) в первую очередь. В то же время молекулы небольшого размера проникают через поры гранул, задерживаются в них и движутся в колонке с более низкой скоростью (рисунок 2.5). Метод гель-фильтрации эффективно используется и при очистке белков от низкомолекулярных примесей.

Высаливание - процесс осаждения белков из раствора при добавлении сульфата аммония, а также солей щелочных и щелочноземельных металлов, чем больше величина заряда белка, тем более высокая концентрация соли требуется для его осаждения.

Ионообменная хроматография - метод, основанный на взаимодействии заряженных групп белка с ионными группами полимеров-ионообменников. При разделении смеси белков наанионите (например, диэтиламиноэтилцеллюлозе) в первую очередь элюируются положительно заряженные белки, затем - нейтральные и, наконец, отрицательно заряженные белки (рисунок 2.6). При разделении смеси белков на катионообменнике(например, карбоксиметилцеллюлозе) элюция происходит в обратном порядке.

Электрофорез - метод, основанный на различной скорости движения белков в электрическом поле на различных носителях (бумага, полиакриламидный и крахмальный гели и т.д.) . Эта скорость зависит от величины заряда белка при данном значении рН.

Способность белков избирательно взаимодействовать с определёнными лигандами составляет основу метода аффинной илибиоспецифической хроматографии. Например, для выделения нужного фермента можно использовать адсорбенты, с которыми ковалентно связан его субстрат, кофермент или специфический эффектор; для извлечения из разделяемой смеси гормонов применяют связывание их иммобилизованными рецепторами и наоборот. Наиболее перспективно для выделения белков использование иммуносорбентов на основе моноклональных антител.

При пропускании смеси белков через биоспецифический сорбент нужный белок удерживается аффинной колонкой, в то время как все остальные компоненты проходят через неё, не задерживаясь. Затем осуществляется элюция специфически связанного белка

Высаливание. Метод основан на различиях в растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.Гель-фильтрация.Метод основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества.Через поры легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают, пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается.Ионообменная хроматография.метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анионообменники, и отрицательно заряженные катионообменники,Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.Аффинная хроматография.метод основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

6. Многообразие белков. Глобулярные и фибриллярные белки. Простые белки: общая характеристика. Сложные белки: классификация, общая характеристика. Классификация белков по биологическим функциям. Семейства родственных белков (сериновые протеазы, иммуноглобулины).Фибриллярные белки — белки, имеющие вытянутую нитевидную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей более 1:10. Полипептидные цепи многих фибриллярных белков расположены параллельно друг другу вдоль одной оси и образуют длинные волокна (фибриллы) или слои.

Большинство фибриллярных белков обладают особым свойством — в формировании их пространственной структуры участвуют, кроме слабых связей, ковалентные непептидные связи, тогда как в глобулярных белках основной вклад в стабилизацию конформации молекулы вносят слабые нековалентные взаимодействия.

Глобулярные белки́ — белки, в молекулах которых полипептидные цепи плотно свёрнуты в компактные шарообразные структуры — глобулы (третичные структуры белка)

Глобулярная структура белков обусловлена гидрофобно-гидрофильными взаимодействиями

Простые белки содержат только аминокислотные цепи, сложные белки содержат также неаминокислотные фрагменты. Эти фрагменты небелковой природы в составе сложных белков называются «простетическими группами: Гликопротеиды,. Липопротеиды, Металлопротеиды,, Нуклеопротеиды, Фосфопротеиды, Хромопротеиды.

Белки выполняют в клетках множество биологических функций

1. Ферменты - специализированные белки, ускоряющие течение химических реакций. Благодаря ферментам в клетке скорости химических реакций возрастают в миллионы раз.

2. Регуляторные белки относят большую группу белковых гормонов, участвующих в поддержании постоянства внутренней среды организма, которые воздействуют на специфические клетки-мишени.

Регуляторные ДНК-связывающие белки, присоединяясь в определённые моменты к специфичным участкам ДНК, могут регулировать скорость считывания генетической информации

3. Рецепторные белки Сигнальные молекулы (гормоны, нейромедиаторы) действуют на внутриклеточные процессы через взаимодействие со специфическими белками-рецепторами.

4. Транспортные белки

5. Структурные белки Некоторые белки, расположенные определённым образом в тканях, придают им форму, создают опору, определяют механические свойства данной ткани

Защитные белки – иммуноглобулины + свертывающая система крови

7. Сократительные белки – актин, миозин, тубулин (микротрубочки)

Сериновые протеазы – содержат серин в АЦ для связывания и каталитического гидролиза пептидных связей в белковых субстратах. Белки – химотрипсин, трипсин, эластаза, факторы свертывания крови

. По форме.Глобулярные. компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде(гемоглобин).Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру(коллагены, эластин, кератин, миозин и тд).По хим строению.Пр белки содержат в своём составе только полипептидные цепи, состоящие из амк остатков(гистоны).Сложные белки кроме полипептидных цепей, содержат в своём составе небелковую часть, присоединённую к белку слабыми или ковалентными связями. (гемопротеины,фосфопротеины,гликопротеины,металлопротеины).По функциям.Ферменты - специализированные белки, ускоряющие течение химических реакций.Регуляторные белки группа белковых гормонов, участвующих в поддержании постоянства внутренней среды организма, которые воздействуют на специфические клетки-мишени..Рецепторные белки сигнальные молекулы (гормоны, нейромедиаторы) действуют на внутриклеточные проц через взаимодействие со специфическими белками-рецепторами.Транспортные белки(альбумин переносит жирные кислоты и билирубин.Структурные белки(коллаген,эластин)Защитные белки(иммуноглобулины,).Сократительные белки(актин,миозин).

Семейство сериновых протеаз.Это семейство ферментов, которые используют уникально активированный остаток серина, расположенный в активном центре, для связывания и каталитического гидролиза пептидных связей в белковых субстратах. Мишени для сериновых протеаз - специфические пептидные связи в белках.

Для всех белков этого семейства характерно наличие в активном центре остатков Сер195, Гис57, Асп102. Некоторые амк замены привели к изменению субстр. специфичности этих белков и к возникновению функционального многообразия внутри этого семейства. Так, пищеварительные сериновые протеазы участвуют в переваривании денатурированных пищевых белков. К ним относят трипсин, химотрипсин, эластазу, но каждый из этих ферментов предпочитает разрывать пептидные связи, образованные определёнными аминокислотами. Семейство иммуноглобулинов Иммуноглобулины, или антитела, - специф. белки, вырабатываемые В-лимф в ответ на попадание в организм чужерод структур, называемых антигенами. Все иммуноглобулины характеризуются общим планом строения. Молекула IgG состоит из четырёх полипептидных цепей: двух идентичных лёгких L, содержащих около 220 амк остатков, и двух тяжёлых Н, состоящих из 440 амк каждая. Все 4 цепи соединены друг с другом множеством нековалентных и четырьмя дисульфидными связями. Поэтому молекулу IgG относят к мономерам. IgM обеспеч первичный иммунный ответ.Структура является наиболее крупномолекулярной. Его молекула являет собой соединенные специальной связью в единую структуру пять мономеров, другими словами: обладает десятью активными центрами. является антигенраспознающим рецептором В-лимфоцитов в мономерной форме.В количественном отношении IgG доминируют в крови и составляют около 75%.В крови IgG обнаруживают только в мономерной форме; он секретируется активированными В-лимфоцитами в больших количествах при вторичном иммунном ответе, когда антиген повторно попадает в организм. IgG не только эффективно связывают и инактивируют чужеродные молекулы и клетки, попавшие в организм, но также облегчают их дальнейшее уничтожение. IgА. Основной класс антител, присутствующий в секретах желёз. IgЕ. мономеры, но, в отличие от IgG, их тяжёлые цепи е содержат не 3, а 4 константных домена. После синтеза и секреции в кровь В-лимфоцитами IgE связываются своими С-концевыми участками с соответствующими рецепторами на поверхности тучных клеток и базофилов. они становятся рецепторами антигенов на поверхности данных клеток.Увеличение количества IgE может предшествовать развитию аллергических реакций. IgD.обнаружены в крови в очень малых количествах. Мономерные белки играют роль рецепторов В-лимфоцитов; других функций у IgD пока не выявлено.

7. Иммуноглобулины, особенности строения, избирательность взаимодействия с антигеном. Многообразие антигенсвязывающих участков Н и L цепей. Классы иммуноглобулинов, особенности строения и функционирования.

Иммуноглобулины – специфические белки, вырабатываемые В-лимфоцитами в ответ на попадание в организм чужеродных структур, называемых антигенами.

Молекула IgG состоит из четырёх полипептидных цепей: двух идентичных лёгких (L - от англ, light), содержащих около 220 аминокислотных остатков, и двух тяжёлых (Н - от англ. heavy), состоящих из 440 аминокислот каждая. Все 4 цепи соединены друг с другом множеством нековалентных и четырьмя дисульфидными связями.

Лёгкие цепи IgG состоят из 2 доменов: вариабельного (VL), находящегося в N-концевой области полипептидной цепи, и константного (CL), расположенного на С-конце. Каждый из доменов состоит из 2 слоев с β-складчатой структурой, где участки полипептидной цепи лежат антипараллельно. β-Слои связаны ковалентно дисульфидной связью примерно в середине домена (рис. 1-45).

Тяжёлые цепи IgG имеют 4 домена: один вариабельный (VH), находящийся на N-конце, и три константных (СН1, СН2, СH3). Домены тяжёлых цепей IgG имеют гомологичное строение с доменами лёгких цепей. Между двумя константными доменами тяжёлых цепей СH1, и СН2 есть участок, содержащий большое количество остатков пролина, которые препятствуют формированию вторичной структуры и взаимодействию соседних Н-цепей на этом отрезке. Этот участок называют "шарнирной областью"; он придаёт молекуле гибкость.

Классы

• Иммуноглобулины М - первый класс антител, синтезирующийся в развивающихся В-лимфоцитах. Мембранно-с вязанная форма иммуноглобулинов М . Созревающие В-лимфоциты синтезируют мономерные бивалентные молекулы IgM, по структуре похожие на рассматриваемые выше IgG, которые встраиваются в плазматическую мембрану клеток и играют роль первых антиген-распознающих рецепторов. Секреторная форма иммуноглобулинов М . Когда В-лимфоциты впервые встречаются в жидкостях организма с неизвестным ранее антигеном, они синтезируют и секретируют в кровь IgM

• Иммуноглобулины G. В количественном отношении IgG доминируют в крови и составляют около 75% от общего количества этих белков. IgG не только эффективно связывают и инактивируют чужеродные молекулы и клетки, попавшие в организм, но также облегчают их дальнейшее уничтожение.

• Иммуноглобулины А. Основной класс антител, присутствующий в секретах желёз организма (слюны, молока, пищеварительного сока, секретов дыхательных путей). В сыворотке крови его содержание не превышает 10-15% от общего количества иммуноглобулинов.

• Иммуноглобулины Е. Содержание этого класса иммуноглобулинов в крови крайне мало. После присоединения антигена хотя бы к двум антигенсвязывающим участкам двух соседних IgE клетка получает сигнал к секреции биологически активных веществ (серотонина, гистамина), хранящихся в секреторных пузырьках. Выброс этих веществ в значительной мере ответственен за развитие воспалительной реакции, а также таких аллергических реакций, как бронхиальная астма, крапивница, сенная лихорадка. Увеличение количества IgE может предшествовать развитию аллергических реакций.

• Иммуноглобулины D. IgD обнаружены в крови в очень малых количествах. Мономерные белки играют роль рецепторов В-лимфоцитов; других функций у IgD пока не выявлено.

8. Биуретовый метод количественного определения содержания белка в сыворотке крови, диагностическое значение. Возрастные особенности нормальных величин белков сыворотки крови. Гипер- и гипопротеинемические состояния. Электрофорез белков сыворотки крови. Белковый спектр в норме и патологии.

Д ля о п р е д е л е н и я к о л и ч е с т в а б е л к а в о б р а з ц е и с п о л ь з у е т с я р я д м е т о д и к :

1.Биуретовый метод 2.Микробиуретовый метод 3.Метод Бредфорда

4.Метод Лоури

5.Спектрофотометрический метод

Биуретовый метод. Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими.Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически. К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

Микробиуретовый метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса, образующегося в результате взаимодействия пептидных связей с Cu2+ в щелочной среде. К 0,2 мл ПМ лимфоцитов, сыворотки или плазмы добавляли 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Выдерживали 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрировали на СФ — 46 при 330 нм. Построение калибровочного графика проводили по стандартному раствору белка.

Электрофорез — это процесс направленного движения частиц, диспергированных в жидкости в постоянном электрическом поле. Частицы одного и того же вещества несут одинаковые по знаку заряды. В электрическом поле положительно заряженные частицы перемещаются к отрицательному электроду — катоду, отрицательно заряженные частицы к положительному электроду — аноду. Движение частиц к катоду иногда называют катафорезом, к аноду — анафорезом. Скорость движения зависит от массы частиц, и их заряда в данных условиях, благодаря чему электрофорез позволяет разделять смеси веществ на составляющие их компоненты.

При помощи электрофореза на бумаге белки сыво­ротки крови можно разделить на 5—7 фракций: альбу­мины, си-глобулины, а2-глобулины, р-глобулины (иногда Pi- и Рг-глобулины) и у-глобулины. При электрофорезе плазмы, кроме того, выявляется фибриноген. 

Общий белок и белковый спектр крови - это группа показателей, которые отражают способность печени и клеток иммунной системы к выработке определенных белков. Общий белок крови состоит из так называемых альбумина и глобулинов. Печень синтезирует альбумин. Эта способность уменьшается при повреждении печеночных клеток, и тогда в анализе белкового спектра отмечается снижение уровня альбумина. Степень снижения соответствует глубине поражения печени: наибольшие отклонения этого показателя характерны для цирроза. При циррозах и аутоиммунных гепатитах увеличиваются концентрации глобулинов, которые вырабатываются иммунными клетками Исследование изменений белкового спектра имеет значение при воспалительных процессах в нервной системе. Обнаруживаемые изменения не являются строго специфическими и не имеют дифференциально-диагностического значения, но позволяют уточнить стадию и активность воспалительного процесса.

Исследование белкового и липопротеинового спектра сыворотки крови особенно значимо для диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушениями обмена белков и дислипопротеидемиями. При многих заболеваниях в сыворотке крови изменяется соотношение отдельных белков (диспротеинемия), хотя общее содержание белка может остаться нормальным.

Содержание общего белка в сыворотке крови здоровых новорожденных составляет 5,68+-0,04 г%. С возрастом это количество увеличивается, особенно интенсивно нарастая в первые три года. В 3-4 года эти величины практически достигают уровня взрослых (6,83+-0,19 г%). Следует обратить внимание на более широкие пределы индивидуального колебания уровня белка у детей раннего возраста (от 4,3 до 8,3 г%), по сравнению со взрослыми людьми, у которых эти величины составили 6,2-8,2 г%. Более низкий уровень белка в плазме крови у детей первых месяцев жизни объясняется недостаточной функцией белковообразовательных систем организма.

В течение онтогенеза меняется и соотношение между альбуминами и различными фракциями глобулинов в плазме крови. В первые месяцы жизни в крови снижено содержание альбуминов (3,7 г%), к 6 годам эта величина возрастает до 4,1 г%, а к 3 годам составила 4,5 г%, что близко к норме взрослого человека. Количество гамма глобулинов, высокое в первые дни после рождения за счет материнской плазмы, постепенно снижается, а затем к 3 годам достигает нормы взрослого человека (17,39 г%). Содержание альфа1-глобулинов у детей до 1 года повышено, к 3 годам уровень их в крови нормализуется. Несколько по иному протекает установление концентрации альфа2-глобулинов. В первые полгода уровень их повышен, к 7 годам он постепенно снижается, а затем достигает уровня, характерного для взрослых. Содержание бета-глобулинов так же достигает взрослого уровня после 7 лет.

Таким образом, белковый состав крови в течение онтогенеза претерпевает ряд изменений: от момента рождения до зрелости происходит увеличение содержания белков в крови, устанавливаются определенные соотношения в белковых фракциях. Функциональные возможности синтезирующих белки плазмы органов, прежде всего печени, относительно низки в момент рождения, постепенно усиливаются, что приводит к нормализации состава крови. При определении общего количества белка различают нормальное его количество, пониженное (гипопротеинемию) и повышенное (гиперпротеинемию).

Гипопротеинемия возникает вследствие:

• недостаточного поступления белка;повышенной потери белка;нарушения образования белка в организме;

сочетания различных из перечисленных причин.

Недостаточное поступление белка может быть при длительном голодании (например, при алиментарной дистрофии, когда содержание белка в плазме может снижаться до 4—2 г/л или при продолжительном соблюдении безбелковой диеты).

Повышенная потеря белка происходит при различных заболеваниях почек (особенно с нефротическим синдромом), кровопотерях, новообразованиях.Нарушение образования белка возможно при недостаточности функции печени (гепатиты, циррозы, подострая дистрофия печени).Небольшая степень гипопротеинемии возможна при беременности вследствие того, что объем циркулирующей крови увеличивается значительнее, чем общее количество белка плазмы.

При изменении интенсивности синтеза или повышении распада белка в крови падает его общее количество. Если же концентрация белка изменяется только вследствие изменения объема внутрисосудистой жидкости, то общее количество белка остается неизменным, снижается только его концентрация. В таких случаях говорят об относительной гипер- или гипопротеинемии, хотя не все считают эти термины удачными.

Гиперпротеинемия нередко развивается как следствие дегидратации в результате потери части внутрисосудистой жидкости. Это происходит при тяжелых травмах, обширных ожогах, холере. При острых инфекциях содержание белка часто повышается от дегидратации и одновременного выброса белков острой фазы. При хронических инфекциях содержание белка в крови может нарастать в результате иммунного процесса с увеличением концентрации иммуноглобулинов.Гиперпротеинемия наблюдается также при появлении в крови парапротеинов — патологических белков, вырабатываемых в большом количестве при миеломной болезни, при болезни Вальденстрема. белковый спектр -характеристика белкового состава плазмы крови и количественного соотношения отдельных белковых фракций; определение Б. с. помогает диагностировать отдельные виды гипо- и гиперпротеинемий, а также заболевания, не сопровождающиеся изменением общего содержания белка в плазме крови.

9. Ферменты, специфичность действия. Классификация и номенклатура ферментов. Структурно-функциональная организация ферментных белков. Активный и аллостерический центры ферментов. Механизм действия ферментов.

Особенности ферментативного катализа

Сходство ферментов с небиологическими катализаторами заключается в том, что:

• ферменты катализируют энергетически возможные реакции;

• энергия химической системы остаётся постоянной;

• в ходе катализа направление реакции не изменяется;

• ферменты не расходуются в процессе реакции.

Отличия ферментов от небиологических катализаторов заключаются в том, что:

• скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми катализаторами;

• ферменты обладают высокой специфичностью;

• ферментативная реакция проходит в клетке, т.е. при температуре 37 °С, постоянном атмосферном давлении и физиологическом значении рН;

• скорость ферментативной реакции может регулироваться.

Специфичность ферментов

Активный центр ферментов - это определенный участок белковой молекулы, способный комплементарно связываться с субстратом и обеспечивающий его каталитическое превращение. Структура активного центра сформирована радикалами аминокислот, так же как и в случае активного центра любого белка. В активном центре фермента имеются аминокислотные остатки, функциональные группы которых обеспечивают комплементарное связывание субстрата (участок связывания), и аминокислотные остатки, функциональные группы которых осуществляют химическое превращение субстрата

Под субстратной специфичностью понимается способность каждого фермента взаимодействовать лишь с одним или несколькими определенными субстратами.

Различают:

- абсолютную субстратную специфичность, если активный центр фермента комплементарен только одному субстрату;

- групповую субстратную специфичность, если фермент катализирует однотипную реакцию с небольшим количеством (группой) структурно похожих субстратов;

- стереоспецифичность, если фермент проявляет абсолютную специфичность только к одному из существующих стереоизомеров субстрата.

4. Каталитическая специфичность, или специфичность пути превращения субстрата, обеспечивает преобразование одного и того же субстрата под действием разных ферментов. Это обеспечивается строением каталитических участков активных центров соответствующих ферментов. Например, молекула глюкозо-6-фосфата в клетках печени человека является субстратом четырех различных ферментов: фосфоглюкомутазы, глюкозо-6-фосфатфосфатазы, фосфоглюкоизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Однако за счет особенностей строения каталитических участков этих ферментов происходят различные превращения глюкозо-6-фосфата с образованием четырех различных продуктов

Действие фермента

I - этап сближения и ориентации субстрата в активном центре фермента; II - образование фермент-субстратного комплекса (Ев); III - образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР); IV - высвобождение продуктов реакции из активного центра фермента

Классификация ферментов

1. Оксидоредуктазы катализируют различные окислительно-восстановительные реакции. Класс делится на подклассы:

а) дегидрогеназы катализируют реакции дегидрирования (отщепления водорода с переносом электронов от дегидрируемого субстрата на другой акцептор)

в) оксигеназы (гидроксилазы) катализируют реакции окисления путем включения атома кислорода в гидроксильную группу молекулы субстрата.

2. Трансферазы - катализируют реакции переноса функциональных групп. В зависимости от переносимой группы подразделяются на подклассы: аминотрансферазы (рис. 2.8), ацилтрансферазы, метилтрансферазы, гликозилтрансферазы, киназы (фосфотрансферазы)

3. Гидролазы катализируют реакции гидролиза (расщепления ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва). Разделяются на подклассы в зависимости от субстрата. Названия образуются в зависимости от молекулы субстрата или конкретной гидролизуемой химической связи: протеазы, амилазы, гликозидазы, нуклеазы, эстеразы, фосфатазы и др.

4. Лиазы - к лиазам относятся ферменты, отщепляющие от субстратов негидролитическим путем определенные группы, такие, как СО2, Н2О, NH2 SH2 и др., или присоединяющие (например, молекулу воды) по двойной связи.

5. Изомеразы катализируют различные внутримолекулярные превращения

6. Лигазы (синтетазы) катализируют реакции усложнения молекулы за счет присоединения друг к другу двух молекул с образованием ковалентной связи; при этом используется энергия АТФ или других макроэргических соединений

10. Характеристика кофакторов ферментов: строение и классификация. Коферменты НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, КоАSH, ГДФ, пиридоксальфосфат, ТГФК: химическ+ая природа, витамины-предшественники, катализируемые реакции.

Простые ферменты — это простые белки, они построены из аминокислот и при гидролизе распадаются только на аминокислоты. Сложные ферменты — это сложные белки, они состоят из простого белка и небелкового компонента. При их гидролизе, помимо свободных аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты её распада.

Белковая часть сложного фермента получила название апофермент, небелковая часть — кофактор.  Кофакторы могут иметь различную химическую природу. активность многих ферментов зависит от небелковых соединений, называемых кофакторами. Молекулярный комплекс белковой части (апофермента) и кофактора называется холоферментом. Роль кофактора могут выполнять ионы металлов (Zn²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, K⁺, Na⁺) или сложные органические соединения. Органические кофакторы обычно называют коферментами, некоторые из них являются производными витаминов. Тип связи между ферментом и коферментом может быть различным. Иногда они существуют отдельно и связываются друг с другом во время протекания реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно и иногда прочными ковалентными связями. В последнем случае небелковая часть фермента называется простетической группой. Роль кофактора в основном сводится к следующему:изменение третичной структуры белка и создание комплементарности между ферментом и субстратом; непосредственное участие в реакции в качестве еще одного субстрата.

Органические вещества неаминокислотной природы, используемые в роли кофакторов, называются коферментами Кофермент + Апофермент ↔ Холофермент

В некоторых случаях в условиях живой клетки равновесие в этой реакции сильно сдвинуто вправо и кофермент прочно связан со своей белковой частью, они не разделяются при выделении и очистке. Такой кофермент называется простетической группой.

В ходе реакции кофермент претерпевает химические превращения, в точности противоположные тем, которые происходят в субстрате. Например, в окислительно-восстановительных реакциях молекула субстрата окисляется, а молекула кофермента восстанавливается. При последующих сопряжённых реакциях изменения в коферменте протекают в обратном направлении и он воспроизводится в первоначальной форме.

Кофермент	Общая роль	Витамин предшественник
NAD+ , NADP+	Перенос водорода (электронов)	Никотиновая кислота - витамин РР
FAD	Перенос водорода (электронов)	Рибофлавин - витамин В2
Кофермент А	Активация и перенос ацильных групп	Пантотеновая кислота
Биотин	Связывание СО2	Биотин
Пиридоксальфосфат	Перенос аминогрупп	Пиридоксин - витамин В6
Тетрагидрофолиевая кислота	Перенос одноуглеродных фрагментов	Фолиевая кислота

11. Ферментативный катализ. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН, концентраций фермента и субстрата. Константа Михаэлиса, физический смысл. Единицы выражения активности ферментов. Принципы количественного определения активности ферментов. – тетр ^{+ единицы} активности

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ (биокатализ), ускорение биохим. р-ций при участии белковых макромолекул, называемых ферментами (энзимами. Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции. Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента. Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.

В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:

Влияние рН на скорость ферментативной реакции

Г рафик зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.

Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции

 

График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента  максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.

 

Фермент	рН-оптимум
Пепсин	1,5
Фосфатаза	5,8
Уреаза	6,7
Трипсин	7,7
Каталаза	7,6
Аргиназа	9,7

 

Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:

a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,

b) ионизацию субстрата,

c) конформацию фермента и его активного центра.

Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.). При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (V_max). При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.

Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

 

Г рафик зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,

где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; K_M – константа Михаэлиса.

Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ V_max, получаем K_M = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.

Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента

Для выражения концентрациифермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активностилюбого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин).

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с^–1 = 60 моль•мин^–1 = 60•10⁶ мкмоль•мин^–1 = 6•10⁷ U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин^–1 = (1/60) мкмоль•с^–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.