95. Методы оценки количества и функциональной активности лимфоцитов.

Для определения количества лимфоцитов стандартным методом используются дорогостоящие проточные цитофлюориметры и гематологические анализаторы . Определение количества лимфоцитов путём розеткообразования. Для проведения реакции розеткообразования нужно изолировать суспензию лимфоцитов из периферической крови. Эту манипуляцию выполняют с помощью градиента плотности фиколл-верографинКольцо мононуклеаров отбирают в отдельную пробирку, трижды отмывают буферным раствором и приготавливают суспензию лимфоцитов с необходимой концентрацией. Для определения количества Т- клеток чаще используют метод розеткообразования с эритроцитами барана. Метод основан на родстве рецептора CD2 с белками мембраны эритроцитов барана. При смешивании лимфоцитов с эритроцитами барана образуются фигуры в виде розеток. Количество розеткообразующих клеток (Е- РОК) соответствует количеству Т- лимфоцитов (CD2+ клеток). Для определения количества В- клеток используют EAC- розетки. Лимфоциты смешивают с эритроцитами быка, обработанными комплементом и антителами к эритроцитам. О функциональной активности Т- и В-лимфоцитов можно судить по ответу в реакции бластной трансформации лимфоцитов. Бластная трансформация лимфоцитов – это переход клетки в митотический цикл после воздействия на нее активирующих факторов. (митогенов). увеличением размеров лимфоцита, увеличением его ядра, изменением ядерно-цитоплазменного соотношения. При этом бласттрансформированная клетка начинает пролиферировать, что можно зарегистрировать по скорости синтеза ДНК. Таким образом, один и тот же процесс – ответ лимфоцита на активирующее воздействие – можно регистрировать микроскопически, определяя процент бласттрансформированных клеток (тогда реакция называется реакцией бласттрансформации) или по включению меченых радиоактивным изотопом нуклеотидов, позволяющих оценить скорость синтеза ДНК (в этом случае реакция называется пролиферативным тестом).

96. Методы исследования функциональной активности фагоцитов.

Для определения активности фагоцитарных клеток используют ряд реакций, основанных на контроле разных этапов фагоцитоза, а также оценке основного эффекта фагоцитарной реакции, а именно – определение численности клеток, способных к фагоцитозу и количества поглощенных объектов фагоцитоза. В основе определения фагоцитарной активности фагоцитов – биологический метод, предполагающий смешивание суспензии клеток-фагоцитов и объектов фагоцитоза. После инкубации этой суспензии (время определяется конкретными условиями и особенностями фагоцитов) осуществляется регистрация результатов.основной популяций фагоцитов, используемых для научных исследований и для иммунодиагностики, являются нейтрофилы периферической крови. В качестве тест-объекта для изучения фагоцитоза могут использоваться как суспензия микроорганизмов (Staphylococcusaureus или Е. coli) так и частицы латекса диаметром 3 мкм.В пробирке смешивают в равных объема микробную и лейкоцитарную взвеси перемешивают и инкубируют при 37° С 30 мин (это время необходимо для миграции нейтрофилов, адгезии микробов на их цитоплазматической мембране и собственно фагоцитоза),затем центрифугируют и из осадка готовят мазки. ФП- процент фагоцитирующих нейтрофилов - процент клеток, вступивших в фагоцитоз от общего их количества, ФП=(число фагоцитов/число всех нейтрофилов)100 %. . ФЧ - фагоцитарное число, среднее число поглощенных микробов - частное от деления общего количества поглощенных микробов на процент фагоцитоза. Через 120 минут смотрят переваривающую способность. Индекс завершённости=ФЧ( после 30 минут инкубации)/ФЧ (после 120). В норме 1,2.