Федеральное агентство по рыболовству федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «мурманский государственный технический университет»

(ФГБОУ ВПО «МГТУ»)

Кафедра микробиологии и биохимии

Методические указания

к лабораторным работам

по дисциплине «Гидромикробиология»

для направления подготовки 06.03.01 Биология

Мурманск,

2016

Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Гидромикробиология» рассмотрены и одобрены на заседании кафедры-разработчика Микробиология и биохимия

«_____» __________________ протокол № __________.

^дата

Составители – Ускова Инга Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии и биохимии; Блинова Екатерина Игоревна, старший преподаватель кафедры микробиологии и биохимии

Рецензент – Мирошниченко Екатерина Сергеевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник кафедры микробиологии и биохимии

Лабораторная работа 1 Количественные методы учета микроорганизмов

Важным микробиологическим показателем, характеризующим водные экосистемы, является общая численность бактерий, определяемая как по прямому счету, так и методами посева на питательных средах. Результаты определения численности бактерий в водных местообитаниях существенным образом зависят от методов, использованных для подсчета бактерий.

Методы учета общей численности бактерий в водных экосистемах по прямому счету

Общая численность бактерий (ОЧБ) в водных экосистемах является значительно более стабильным показателем, по сравнению с численностью гетеротрофных бактерий по посеву. Пределы колебаний этого показателя в одном и том же водоеме редко превышают один порядок величин, тогда как для численности евтрофных или олиготрофных бактерий размах колебаний обычно составляет несколько порядков.

Известно, что содержание бактерий в воде находится в тесной связи с трофическим типом водоёма. Преимущество микробиологической индикации степени трофии водоёмов по величинам ОЧБ состоит в относительной стабильности этого показателя в течение года. Поэтому о типе водоёма можно судить по пробам, отобранным в любой период времени.

При учете бактериальных клеток прямым микроскопическим методом достоверный подсчет их количества является одним из важнейших моментов. Завышение или занижение величин количественных характеристик бактериопланктона может привести к неадекватной оценке его структурной и функциональной роли в водоеме.

Для определения общей численности бактерий используют прямой микроскопический метод, при этом учет численности проводят либо методом световой микроскопии с окраской бактерий раствором карболового эритрозина, либо в люминесцентном освещении с окраской клеток акридиновым оранжевым.

Определение общей численности бактерий (ОЧБ) методом люминесцентной микроскопии

Для учета ОЧБ используют метод люминесцентной микроскопии с использованием красителя акридинового оранжевого.

Реактивы: спиртовой раствор Судана черного (перенасыщенный), спирт 70 %, формалин 40 %, профильтрованная дистиллированная вода, порошок акридинового оранжевого, нефлюоресцирующее масло.

Оборудование и посуда: люминесцентный микроскоп, фильтры, пробирки, пипетки.

Приготовление акридинового оранжевого:

- 0,2 г порошка АО растворить в 200 мл профильтрованной (через 0,45 мкм фильтр) дистиллированой водой (раствор 0,1 %).

- в готовый раствор АО добавить 12 мл 40 % формалина

- хранить готовый раствор в холодильнике.

Порядок выполнения работы:

1. Подготовить фильтровальную установку.

2. Профильтровать исходный раствор АО в необходимом количестве.

3. Пробы воды предварительно встряхивают в течение одной минуты, затем дают пробе отстояться в течение минуты для оседания крупной взвеси.

4. Отобрать 2 мл пробы и добавить 0,5 мл свежеприготовленного раствора АО.

5. Окрашивать 5 мин.

6. Смочить фильтр спиртом, высушить его.

7. Смочить фритту дистилированной водой и уложить фильтр, собрать фильтровальную установку.

8. В воронку влить окрашенную пробу, фильтровать под слабым вакуумом.

9. После фильтрации фильтр подсушивают на воздухе.

10. Затем на поверхность предметного стекла наносят маленькую каплю нефлюоресцирующего масла и помещают на нее мембранный фильтр. Сверху на фильтр также наносят каплю нефлюоресцирующегоо масла и накрывают его покровным стеклом. Пинцетом выдавить пузырьки воздуха, накапать нефлюоресцирующего масла.

11. Подсчет клеток проводят с помощью люминесцентного микроскопа МИКМЕД-1 со светоделительной пластиной «зеленая» с иммерсионным объективом (100х) и окуляром (15х) с сетчатым микрометром. Подсчет ведут не менее чем в 20 полях зрения.

Количество бактерий, содержащихся в 1 мл рассчитывают по формуле:

,

где X - количество бактерий в 1 мл;

е - площадь фильтра, мм²;

а - просчитываемая площадь, мкм²;

ж - объем профильтрованной про­бы воды, мл;

г- число полей зрения, в которых считали клетки;

n - сумма подсчитанных бактерий в г полях зрения;

10⁶ - коэффициент для пересчета мм² в мкм².