2.3. Цитохімія.

Дослідженнями, що спрямованими на виявлення специфічних речовин і характеру розподілу їх у клітині займається цитохімія. При цитоембріологічних дослідженнях важливо одержати дані про локалізацію речовин у клітині.

Завдання цитохімії не обмежуються тільки якісним аналізом. Велике значення має кількісний аналіз речовин у клітині під час її функціонування. Розроблено методи цитохімічного функціонування основних речовин, які входять до складу структур клітини (білків, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ферментів і т.д.). При цитохімічному визначенні речовин необхідно враховувати дві основні умови: специфічність фарбника і сталість локалізації речовин.

Найкращим прикладом такої реакції є реакція Фельгена для виявлення ДНК. Відомо, що до складу ДНК входять залишки фосфорної кислоти, цукор (£-дезоксирибоза) і азотисні основи. Дезоксирибоза в ході гідролізу з соляною кислотою перетворюється в альдегід, який при взаємодії з фуксин-сернистою кислотою (реактив Шиффа) зафарбовується в червонувато-фіолетовий колір. Таким чином, реакція Фельгена складається з 2-х етапів: гідролізу і зафарбовування. Зв'язок фарбника, у даному випадку, кількісний. Кількість продукту цитофотометричної реакції визначають за допомогою цитофотометрії (цитофотометрія (від цито..., фото... і ...метрія ) - один з методів кількісної цитохімії, що дозволяє визначати хімічний склад клітин у гістологічному препараті за поглинанням світла клітинами) за поглинанням речовиною світла певної довжини хвилі. Інтенсивність поглинання променів пропорційна концентрації речовини. Якщо відома площа або обсяг структури, що вимірюється і значення поглинання, можна визначити концентрацію і абсолютний вміст речовини. Для визначення кількості ДНК, після реакції Фельгена, необхідно: виявити вміст фуксина, який зафарбовує ДНК у червоний колір, кількість якого прямопропорційна вмісту ДНК.

Кількість нуклеїнових кислот і білків у клітині визначають методом ультрафіолетової цитофотометрії, яка базується на тому, що різні речовини поглинають ультрафіолет у різних ділянках спектра. Кількість речовин визначають за поглинанням у специфічній зоні ультрафіолетового спектра.

2.4. Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія.

Базується на тому, що багато речовин, при опроміненні короткохвильовими променями, переходять у стан збудження, поглинаючи енергію цих променів. Речовини, що збуджуються, дають оптичне випромінювання.

Використовуючи методи кількісної флуорометрії, можна визначити вміст речовин у клітині. Наприклад, флуорохром акридиловий оранжевий вибірково зв'язується з нуклеїновими кислотами. Із ДНК він зв'язується в мономерній формі і флуоресціює зеленим світлом, із РНК у химерній формі і флуоресціює червоним світлом. За ступенем свічення визначають кількість речовин, з якими зв'язуються флуорохроми.

Метод люмінесцентного аналізу має важливе значення для визначення фізико-хімічного стану нуклеїнових кислот. Препарати попередньо обробляють так, щоб усунути ліпіди і РНК або ацетилувати гістони, що дає можливість встановити зв'язок нуклеїнових кислот з білками і ліпідами, визначити їх структурний стан в хроматині ядер.

Для з'ясування місць синтезу біополімерів і динаміки синтетичних процесів використовують метод авторадіографії, який базується на використанні мічених радіоактивними ізотопами речовин.

На препарати тканин рослин, у які були введені радіоактивні ізотопи, накладають фотоемульсію. Після певної експозиції ці препарати проявляють і знаходять на них місця локалізації зерен срібла, які розміщуються напроти місць, де міститься мічена речовина. За інтенсивністю мічення можна визначити відносний вміст радіоактивної речовини в різних ділянках клітини.