5.3. Электроанализ в биоорганической химии
Электрохимические методы анализа (ЭХМА) основаны на изучении зависимости электрических параметров химической системы от концентра- ции, природы и структуры ее компонентов. Наибольшее распространение в практике анализа получили методы потенциометрии, кулонометрии, кон- дуктометрии и вольтамперометрии.
Все методы высокоэффективны при выполнении количественного анализа. Одновременно определить количественный и качественный состав системы позволяют методы вольтамперометрии.
В настоящее время в практике экоаналитических лабораторий широко используется метод инверсион- ной вольтамперометрии, позволяющий по результатам одного анализа определить более десяти микрокомпонентов (в том числе и ионов тяжелых металлов) при концентрации от 10-3 до 1 мг/дм3.
Высокая селективность этого метода дает возможность выполнять анализ многокомпонентных систем, не прибегая к сложной схеме разделения и выделения интересующего компонента с последующим его определением в изолированном виде.
Электрохимические методы характеризуются высокой чувствительностью, селективностью, экспрессностью и позволяют проводить измерения 8 с достаточно высокой точностью (от 0,05 до 10 %) и воспроизводимостью в широком интервале концентраций (от 10 -9 до 1 моль/дм3 ). В отличие от химических методов, электрохимический анализ высокоэффективен при исследовании разбавленных растворов. Неоспоримым достоинством электро- химических методов является возможность анализа мутных, окрашенных и агрессивных растворов. Эти методы могут быть признаны наиболее перспективными для автоматизации аналитического контроля технологических по- токов и сточных вод, которые содержат значительные количества взвешен- ных примесей и окрашенных веществ.
Классификация электрохимических методов анализа
Согласно рекомендациям ИЮПАК ( Международного союза теоретической и прикладной химии), электрохимические методы анализа делятся на две основные группы:
- методы, основанные на электрохимических реакциях;
- методы, в которых строение двойного электрического слоя не учитывается.
В первую группу входят методы потенциометрии, в которых электродная реакция происходит в отсутствие тока, и методы, основанные на частичном (вольтамперометрия) или полном (кулонометрия, электрогравиметрия) электрохимическом превращении определяемого вещества под действием внешнего тока.
Вторая группа методов основана на измерении электропроводности анализируемой системы (кондуктометрия и высокочастотное титрование). Методически различают прямые и косвенные электрохимические методы анализа. В прямых измерениях используется зависимость «электрический сигнал - состав». Для определения концентрации при этом применяют методы градуировочного графика, сравнения или стандартных добавок. Косвенные электрохимические методы используются для индикации конечной точки титрования при выполнении титриметрического анализа. К ним относятся методы потенциометрического, кулонометрического, амперометрического, кондуктометрического и высокочастотного титровании.
Вопросы для проверки полученных знаний.
1. Хроматографические методы анализа
2. Качественный хроматографический анализ,
3. Количественный хроматографический анализ
4. Количественный хроматографический анализ
5. Адсорбционная хроматография
6. Распределительная хроматография
7. Ионообменная хроматография
8. Проникающая хроматография
9. Осадочная хроматография
10. Адсорбционно-комплексообразовательная хроматография
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 22. ПРИМЕНЕНИЕ ТОНКОСЛОЙЕНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В БООРГАНИКЕ.
Цель работы: ознакомиться с методом тонкослойной хроматографии углеводов.
Принцип метода. При проведении хроматографического разделения углеводов методом тонкослойной хроматографии пластинку с тонким слоем пористого носителя (например, пластинку SiluFol), на которую нанесены растворы углеводов, помещают в растворитель, который, продвигаясь за счет капиллярных сил, перемещает углевод. По завершению хроматографии проводят обработку пластинки, позволяющую выявить пятна углевода, и расчетным методом определяют массу углевода в исследуемом растворе.
Оборудование и реактивы: пластинки Silufol или SilufoI–UV, исследуемый (раствор меда) и стандартный (10 мкг в пробе) раствор углевода (глюкозы, галактозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы), растворитель — смесь бутанол-ацетон-вода (4:5:1), в случае использования пластинок Silufol нафторезорциновый реактив (свежеприготовленная смесь равных объемов 20 %-го водного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,2 %-го спиртового раствора нафторезорцина). Микропипетки, пульверизатор в случае использования пластинок SilufoI или источник ультрафиолетового света в случае использования пластинок Silufol–UV, хроматографическая камера, линейка, простой карандаш, планиметр, сушильный шкаф.
Ход работы
Ha пластинке на расстоянии 2 см от нижнего края (линия старта) аккуратно намечают карандашом три точки нанесения растворов углеводов. C помощью микропипетки в отмеченные места наносят равные объемы исследуемого раствора углевода (5 – 20 мкг в пробе), разбавленного исследуемого раствора углевода и стандартного раствора углевода таким образом, чтобы получить пятна одного диаметра. После высушивания пятен пластинку помещают в хроматографическую камеру, на дне которой находится растворитель – смесь бутанол-ацетон- вода (4 :5:1). Высота слоя растворителя – 1 см. Хроматографию проводят до прохождения растворителем 10 см от линии старта. После этого хроматограмму высушивают и проявляют. При использовании пластинок Silufol хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором нафторезорцина и сушат в сушильном шкафу 5 – 10 мин при температуре 90 – 100 ºС для проявления пятен углевода. Пятна глюкозы и галактозы имеют сине –фиолетовый цвет, фруктозы – красно-черный, сахарозы и мальтозы – красный, лактозы – красно–фиолетовый, рамнозы – зеленый, ксилозы – светло–серый, манозы – светло–синий, арабинозы – сине–зеленый.
B случае использования пластинок Silufol–UV пятна углевода выявляют под ультрафиолетовым светом.
Определяют площадь пятен. Массу углевода в пробе исследуемого раствора (мкг) рассчитывают по формуле
,
где Мst – масса углевода в пробе стандартного раствора;
Sst, S, Sp – площади пятна стандарта; исследуемого раствора и разбавленного исследуемого раствора;
P – фактор разведения.
Оформление работы
Привести расчеты по приготовлению реактивов. Провести ТСХ углеводов, идентифицировать их и определить содержание в пробе.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №23. ПРИМЕНЕНИЕ РАСПЕРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В БИООРГАНИКЕ.
Теоретическое введение. Довольно точным и доступным является метод распределительной хроматографии на бумаге (модификация адсорбционной хроматографии). При этом методе в качестве адсорбента используют специальную фильтровальную бумагу. Хроматографию проводят в закрытой камере, чтобы избежать испарения растворителя (рисунок 5.1).
Рисунок 5.1 – Устройство камерфы для бумажной хроматоргафии.
Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге используют для определения аминокислотного состава белка, для качественного и количественного определения аминокислот в биологических жидкостях и тканях. Этот метод позволяет выделить отдельные вещества из небольшого количества сложной смеси (рисунок 5.2).
Рисунок 5.2. Двухкамерная хроматограмма гидролизата белка на бумаге
Опыт № 1 Количественное определение аминокислот методом хроматографии на бумаге
Оборудование и реактивы: хроматографическая бумага; хроматографическая камера; фотоэлектроколориметр; ножницы; пластинки стеклянные (3х32 см) – 3 шт.; держатель для хроматограмм; сушильный шкаф; микропипетки; пробирки с притертыми пробками; бюретка на 25 л; стандартная смесь аминокислот; испытуемая смесь аминокислот; бутанол, уксусная кислота, вода в соотношении 15:3:7; 1%-й раствор нингидрина в 95%-ом ацетоне; этиловый спирт (75%-й), насыщенный медным купоросом. Выполнение работы. Берут лист хроматографической бумаги размером 18х28 см и на расстоянии 3 см от его короткого края проводят простым карандашом горизонтальную линию. Затем ее делят на неравные отрезки в соответствии с прилагаемой схемой и выделяют стрелками границы нанесения стандартной и испытуемой смесей и делают соответствующие надписи простым карандашом.
Бумагу укрепляют над поверхностью стола и на линию старта, ограниченную стрелками, наносят сначала стандартную смесь при помощи специальной микропипетки тонкой линией, пока весь раствор из микропипетки не будет перенесен на стартовую линию (микропипетку заполняют на 2–3 см). Измеряют массу нанесенного раствора, для чего взвешивают пипетку, заполненную стандартной смесью (до нанесения раствора), и пустую (после нанесения раствора). На бумагу обычно наносят 0,02–0,03 г стандартного раствора. Затем заполняют чистую пипетку испытуемой смесью аминокислот (выданной преподавателем для исследования), взвешивают ее и наносят смесь на линию старта с соответствующей пометкой.
Приготовленную хроматограмму помещают в хроматографическую камеру с предварительно налитой в нее системой растворителей для разделения смеси аминокислот, например смеси бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:3:7.
Разделение ведут методом восходящей хроматографии, пока линия фронта не дойдет на 2–3 см до верхнего края хроматографической бумаги (линия финиша). После этого хроматограмму вынимают из камеры, верхний конец бумаги немедленно вставляют в держатель, сделанный из трех скрепленных резиновым кольцом стеклянных палочек, и помещают на 20 мин в вытяжной шкаф для удаления из бумаги растворителей.
Высушенную хроматограмму обмакивают в 1%-й раствор нингидрина в ацетоне для обнаружения на ней положения пятен аминокислот. Затем хроматограмму помещают на 10 мин в вытяжной шкаф для удаления ацетона и переносят в сушильный шкаф, где оставляют ее на 15 мин при 70°С. Аминокислоты стандартной и испытуемой смесей обнаруживают в виде сине-фиолетовых пятен, расположенных цепочкой по направлению движения системы растворителей от линии старта к верхнему краю хроматограммы.
Рисунок 5.3 - Схема расположения аминокислот на хроматограмме:
А – точка нанесения смеси аминокислот; 1 – цистин и цистеин; 2 – лизин; 3 – гистидин; 4 – аргинин; 5 – аспарагиновая кислота, серии и глицин; 6 – глутаминовая кислота и треонин; 7 – аланин; 8 – пролин; 9 – тирозин; 10 – валин и метионин; 11 – триптофан; 12 – фенилаланин; 13 – лейцин и изолейцин
Идентификацию аминокислот, содержащихся в испытуемой смеси, ведут по совпадению на хроматограмме позиций, занимаемых аминокислотами стандартной и испытуемой смесей (рисунок 5.3).
Для определения количественного содержания аминокислот в испытуемых смесях хроматограмму расчерчивают простым карандашом так, чтобы лежащие на одном уровне окрашенные зоны, соответствующие одной и той же аминокислоте оказались заключенными внутри примерно одинаковых прямоугольников (рисунок 5.4).
Рисунок 5.4. Схема расположения аминокислот на хроматограмме:
I – смесь № 1; II – смесь № 2; IV – смесь № 3; III – стандартная смесь аминокислот
Очерченные участки бумага вырезают и помещают в пробирки, номера которых должны соответствовать номерам пятен на хроматограммах. В каждую пробирку наливают из бюретки по 10 мл 75%-го раствора этилового спирта, насыщенного сульфатом меди (к 500 мл этилового спирта добавляют 0,2 мл нащенного раствора сульфата меди). Пробирку закрывают пробкой и, периодически перемешивая, добиваются полного перехода кирпично-красной окраски (медной соли сине-фиолетового Руэмана) с бумаги в раствор. На это уходит 15–20 мин. Абсорбцию (оптическая плотность) стандартного и испытуемого растворов измеряют на фотоэлектрокалориметре с зеленым светофильтром (540 нм). В поток сравнения устанавливают кювету с 75%-ым раствором этилового спирта с сульфатом меди.
Количественное содержание аминокислот в исследуемом растворе рассчитывают по соотношению экстинкций исследуемой и стандартной проб.
Пример расчета. Допустим, что в стандартной смеси содержится 1,8 мг глицина в 1 мл, на стартовую полосу нанесено 0,02 г этого стандартного раствора. Следовательно, на хроматограмму поступило (1,8х0,02) = 0,036 мг глицина. Условимся далее, что абсорбция окрашенных растворов составила 0,288 для стандарта и 0,336 для неизвестной смеси. Тогда содержание глицина в исследуемой смеси, нанесенной на хроматограмму, составит (36х0,336): 0,288=42 мкг. Если далее принять, что исследуемая смесь нанесена на хроматограмму в количестве, например, 0,0250 г, то содержание глицина в 1 мл исследуемого раствора составит (42:0,0250) = 1680 мкг, или 1,68 мг/мл.
Оформите результаты собственного эксперимента, сделайте по ним выводы.
Казин, В. Н. Физико-химические методы анализа: лабораторный практикум / В. Н. Казин, Т. Н. Орлова, И. В. Тихонов; Яросл. гос. ун-т им. П. Г. Демидова. – Ярославль : ЯрГУ, 2011. – 72 с.
Опыт №2 Радиальная хроматография является одной из разновидностей метода распределительной хроматографии.
Принцип метода. Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель, например фенол.
Рисунок 5.3 - Бумажный диск в чашке Петри.
Диск разделен на четыре части. Фенол движется (темное пятно) от центра к периферии и увлекает за собой аминокислоты, нанесенные в каждой четверти диска.
Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен быть полярным (неподвижная фаза), а другой неполярным – подвижная фаза. Более гидрофобная аминокислота или другое вещество, лучше растворяющееся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.
Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри (рисунок 5.3). Растворитель перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые распределяются концентрическими кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции
Ход работы. 1. В центре бумажного диска или квадрата из хроматографической бумаги, стороны которого на 1 см больше диаметра чашки Петри, делают вырез около 1 см в диаметре. Простым карандашом диск делят на 4 части по диагоналям, затем помещают его на ножку, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки высотой 2 см, вставленной в вырез диска (см. рисунок 5.3). Диск следует держать за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме.
2. Отступив от центра на 1 см, в каждом секторе диска обводят простым карандашом кружки и обозначают их цифрами 1, 2, 3, 4. Наносят капилляром небольшое количество (1—2 капли) исследуемых растворов аминокислот: аланина (1), глутамина (2) и лейцина (3). В четвертый сектор (4) наносят смесь аминокислот. При нанесении исследуемых аминокислот в каждый кружок следят за тем, чтобы капля наносимого раствора не заходила за кружок. После нанесения раствора бумагу необходимо просушить на воздухе в течение 10 мин, чтобы не было влажного пятна.
3. На дно чашки Петри (одного диаметра с крышкой ее) наливают 10 мл водонасыщенного раствора фенола так, чтобы ножка диска погружалась в раствор. Чашку Петри накрывают крышкой и проводят хроматографическое разделение в течение 40—50 мин при комнатнойтемпературе. По ножке растворитель поднимается вверх и распределяется по окружности бумажного диска, увлекая за собой нанесенные аминокислоты. При этом происходит разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью, соответственно коэффициентам их распределения между водой и фенолом. Когда фронт растворителя дойдет почти до края бумажного диска, крышку чашки Петри снимают, на нее кладут бумажный диск, удерживая пинцетом его края, и помещают в термостат при температуре 90—100 оС на 10 мин с целью устранения растворителя – фенола и фиксации аминокислот.
4. Дли выявления пятен аминокислот хроматограмму опрыскивают 0,2% раствором нингидрина (ацетоновым или спиртовым) либо сухую хроматограмму быстро, одним движением, смачивают раствором нингидрина, налитым в чашку Петри, и вновь высушивают в сушильном шкафу при температуре 90—100°С в течение 5 мин.
При этом проявляются аминокислоты в виде отдельных трех полос, окрашенных в розово-фиолетовый цвет, где каждое пятно соответствует определенной аминокислоте
Сравнивая расположение пятен в исследуемой смеси с положением пятен в отдельных аминокислотах, устанавливают присутствие в смеси определенных аминокислот. Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент распределения — Rf или скорость перемещения по формуле:
Rf = a/b,
где а — расстояние вмиллиметрах, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна;
b — расстояние в миллиметрах от места нанесения аминокислоты (линии старта) до фронта растворителя.
Чем меньше растворимость аминокислоты в воде и чем больше ее растворимость в феноле или в другом органическом растворителе, тем быстрее она движется вслед за фронтом органическогорастворителя, тем больше величина Rf, и, наоборот, чем больше ее растворимость в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше величина Rf. Коэффициент распределения Rf – величина постоянная для каждой аминокислоты при постоянных условиях опыта (температура, сорт бумаги, растворитель). Сравнивают коэффициент распределения известных стандартных аминокислот с коэффициентом распределения аминокислот, полученных для исследуемой смеси и определяют наличие отдельных аминокислот в исследуемом материале.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 24. КОЛОНОЧНАЯ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ БИИОРГАНИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ.
Для метода гель-фильтрации используются так называемые молекулярные сита — инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Их получают из бактериальных полисахаридов (сефадексы), агара или полимеризованных акриламидных гелей (акрилекс).
Принцип метода. Молекулы разных размеров различают по способности проходить через поры внутрь гранул геля. Небольшие молекулы, эффективно проникающие внутрь гранул сквозь поры, проходят через колонку, заполненную гелем, медленнее, чем вещества, молекулы которых слишком велики. Об эффективности разделения смеси судят по составу вытекающего из колонки раствора (элюат).
При работе с колонкой необходимо соблюдать следующие правили (рисунок 5.4).
1. Над гелем должен находиться слой изотонического раствора хлорида натрия, чтобы гель не высыхал.
2. При отсутствии капельницы изотонический раствор хлорида натрия добавляют в колонку аккуратно через воронку из маленького стаканчика, регулируя скорость элюирования, открыв нижний зажим колонки.
3. При разделении смеси длягель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости (т.е. открыт зажим снизу).
Ход работы. Колонку для разделения вещества заполняют гелем, полученным при гидратировании акрилекса Р-200 изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхность геля наносят 2-3 капли фракционирующего раствора, представляющего собой смесь трех веществ: насыщенного раствора голубого декстрана (относительная молекулярная масса порядка 107), рибофлавина (относительная молекулярная масса около 3102) и гемоглобина (относительная молекулярная масса 64,5·103). В качестве фракционирующего раствора можно использовать также смесь (1:1) двух веществ: насыщенногораствора голубого декстрана и насыщенного раствора бихромата калия — К2Сr2О7 (относительная молекулярная масса — 294, 22). Фракционирующий раствор (смесь 3 или 2 веществ) должен сначала впитаться гелем, затем в колонку вносят 2 раза по 2 мл изотонического раствора хлорида натрия. После этого подключают капельницу с изотоническим раствором хлорида натрия, предназначенным для элюирования (вымывания) разделяемых веществ. По мере прохождения через колонку элюирующего изотонического раствора хлорида натрия смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каждую фракцию собирают в отдельную центрифужную пробирку. В соответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюируется декстран (голубой), затем гемоглобин (красный) и рибофлавин или бихромат калия (желтый).
Рисунок 5.4 - . Схема устройства для гель-фильтрации.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 25. ХРОМАТОРГАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ.