Выделение нуклеопротеинов из дрожжей
Реактивы: дрожжи пекарские, прессованные; 1 %–й раствор гидроксида натрия; ацетат натрия; речной песок, тщательно промытый и прокаленный.
Оборудование: ступка с пестиком; воронка для фильтрования, химические стаканы; стеклянная палочка.
Ход работы
К 6 гпекарских дрожжей добавьте 2 см3 воды, немного песка и полученную смесь разотрите в ступке с 1 %–м раствором гидроксида натрия. Раствор щелочи добавляйте небольшими порциями (по 2 – 3 см3), всего расходуйте около 25 см3. Массу дрожжей растирайте около 15–20 мин до получения гомогенной массы.
Содержимое ступки профильтруйте через складчатый фильтр и перелейте в стакан.
Затем в стакан добавьте5 гацетата натрия и, перемешивая стеклянной палочкой, растворите его.
По стенке стакана осторожно наслоите 25 мл этанола. Медленно круговыми движениями перемешайте жидкости. Образуются крупные хлопья нуклеопротеинов, которые постепенно осаждаются на дно стакана.
Отделите осадок нуклеопротеинов фильтрацией на бумажном фильтре или декантацией. Полученные нуклеопротеины сохраните для следующего опыта.
Оформление результатов
Опишите ход выполнения работы.
Опыт №2 Гидролиз нуклеопротеинов. При выполнении данной работы следует соблюдать особую осторожность!
Гидролиз нуклеопротеинов протекает в кислой среде по нижеприведенной схеме.
Реактивы: осадок нуклеопротеинов, полученный в опыте №1; 5 %–й раствор серной кислоты; концентрированная серная кислота; 10 %–й раствор гидроксида натрия; 20–25 %–й раствор аммиака; 1 %–й раствор сульфата меди; 1 %–ый спиртовой раствор тимола; 1 %–й раствор нитрата серебра; молибденовый реактив (3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 см3 воды и добавляют 50 см3 32 %–го раствора азотной кислоты (плотностью 1,200 г/ см3).Полное растворение молибдата аммония происходит при добавлении кислоты).
Оборудование: круглодонная колба с обратным холодильником; электрическая плитка; воронка для фильтрования; индикаторная бумага; бумажный фильтр.
Ход работы
Задание 1. Гидролиз нуклеопротеинов.
Осадок нуклеопротеинов, полученный в предыдущей работе, растворите в 25 см3 5 %–го раствора серной кислоты и перенесите в круглодонную колбу.
Колбу закройте пробкой с обратным холодильником. Реакционную смесь нагрейте на электрической плитке до кипения и кипятите в течение 1,5 ч.
Смесь охладите и профильтруйте через бумажный фильтр. С фильтратом проделайте реакции нижеследующих заданий.
Задание 2. Обнаружение полипептидов.
К 2 см3 фильтрата прилейте 2 см3 10 %–го раствора щелочи и 2 капли раствора сульфата меди. Образуется характерное для полипептидов окрашивание.
Задание 3. Обнаружение пуриновых оснований.
К 5 каплям 1 %– го раствора нитрата серебра приливайте концентрированный раствор аммиака до растворения образовавшегося вначале осадка.
В другую пробирку влейте 2 см3 фильтрата (задание 1) и приливайте к нему концентрированный раствор аммиака до щелочной по индикаторной бумаге реакции.
Во вторую пробирку влейте содержимое первой пробирки. Через несколько минут выпадают хлопья солей пуриновых оснований.
Задание 4. Обнаружение пентоз.
К 1 см3 фильтрата добавьте 2–3 капли 1 %–го раствора тимола и по стенке пробирки ОСТОРОЖНО наслоите
1 см3 концентрированной серной кислоты. Жидкость окрашивается в красный цвет.
Задание 5. Обнаружение фосфорной кислоты.
К 1 см3 фильтрата прилейте равный объем молибденового реактива.
Содержимое пробирки нагрейте до кипения и кипятите в течение 2–3 минут. Появляется желтое окрашивание, обусловленное образованием комплексной соли. При стоянии выпадает желтый осадок.
Оформление результатов
Опишите ход выполнения работы, опишите компоненты входящие в состав нуклеопротеинов.
Практическое задание
1) Запишите формулы нуклеотидов ГТФ, УДФ, дАМФ, дТДФ, дЦТФ.
a) в составе нуклеотидов обведите карандашом пуриновые азотистые основания;
б) подчеркните нуклеотиды, содержащие рибозу, одной чертой, а нуклеотиды, содержащие дезоксирибозу – двумя чертами.
2) Напишите формулу тринуклеотида А–Ц–Г.
a) укажите фосфодиэфирные связи;
б) отметьте 5’– и 3’–концы.
3)Дан фрагмент одной из цепей ДНК:
Г–Ц–Т–А–А–Т–Ц–Г–Ц–Т–А–Г.
a) Запишите нуклеотидную последовательность второй комплементарной цепи;
б) укажите 5’– и 3’–концы в цепях ДНК.
4) Фрагмент иРНК имеет следующую нуклеотидную последовательность:
5’А–Ц–У–А–Ц–Ц–А–Ц–А–А–Ц–Г–У–Г–А3’
a) определите, сколько аминокислот закодировано в данном фрагменте;
б) пользуясь таблицей генетического кода, определите закодированную аминокислотную последовательность;
в) по фрагменту иРНК установите первичную структуру обеих цепей ДНК, отметьте транскрибируемую цепь, укажите 5’– и 3’–концы в цепях ДНК.
5) Пептид имеет следующую структуру:
фен–ала–арг–гли–тре–сер
a) может ли несколько иРНК, отличающихся друг от друга первичной структурой, кодировать данный пептид или нет?
б) запишите две различные последовательности иРНК, кодирующие данный пептид, укажите 5’– и 3’–концы в иРНК.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 21. ЖИРОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
К витаминам относят низкомолекулярные органические вещества различной химической природы и, следовательно, обладающие различными физико-химическими свойствами. Они условно объединены в одну группу по признаку абсолютной жизненной необходимости для организмов.
В основу классификации витаминов положена их растворимость. По этому признаку витамины делят на две большие группы: жирорастворимые и водорастворимые. К жирорастворимым витаминам относят витамины А, Д, Е и К. Водорастворимые витамины – витамины группы В, фолиевая кислота, биотин, витамин С, пантотеновая кислота.
Опыт №1. Качественные реакции на витамины группы А.
Витамины группы А. Витамин А – группа природных соединения, производных β-ионона. Это кристаллические вещества, нерастворимые в воде, но хорошо растворяющиеся в органических растворителях.
Важнейшие представители: витамин A1, (ретинол), витамин А2 (дегидроретинол), ретиналь.
Источниками витамина А для человека являются рыбий жир, желток яйца, печень рыб и домашних животных, сливочное масло, молоко, сметана, красные овощи (морковь, перец, томаты и др.)
В овощаx витамин А содержится в виде провитамина A –β-ка-ротина. Молекула β-каротина распадается в кишечнике человека и животных с образованием двух молекул витамина А1.
Реакция с серной кислотой. Реактивы и материалы: хлороформ; масляный экстракт витамина А; рыбий жир; концентрированная серная кислота.
Порядок выполнения работы. В пробирку вносят 2 капли масляного раствора витамина А, 2 капли хлороформа, 2–4 капли серной кислоты. Появляется синее окрашивание, переходящее в темно-красное и коричневое.
В основе реакции лежит способность серной кислоты отнимать у витамина А воду с образованием цветных продуктов реакций.
Реакция с сульфатом железа.
Реактивы и материалы: хлороформ; масляный экстракт витамина А; рыбий жир; концентрированная серная кислота; насыщенный раствор сульфата железа (II) в уксусной кислоте.
Порядок выполнения работы. К 2 каплям рыбьего жира или 0,05 % раствора витамина А в хлороформе добавляют 5–10 капель ледяной уксусной кислоты, насыщенной сульфатом железа (II) и 1 –2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное. Каротины дают при этой реакции зеленое окрашивание.
Обнаружение каротина в шиповнике.
Во многих растениях содержатся провитамины – каротины, выделенные впервые из моркови. Для их обнаружения из растительного продукта приготавливают хлороформенный экстракт и добавляют к нему серную кислоту.
Реактивы и материалы: ягоды шиповника; хлороформ; концентрированная серная кислота.
Порядок выполнения работы. Приготовление хлороформенного экстракта: в сухую пробирку помещают ягоды шиповника и добавляют хлороформ до 1/3 объема пробирки. Встряхивают пробирку до тех пор, пока жидкость не окрасится в оранжевый цвет. Полученный раствор отделяют фильтрованием.
В сухую пробирку помещают 5 капель экстракта и добавляют 1–2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется характерное для витаминов А синее окрашивание.
Обнаружение ненасыщенных связей в каротине. Наличие в соединениях ненасыщенных связей обнаруживают по способности обесцвечивать бромную воду.
Характерная оранжевая окраска каротина обусловлена наличием системы сопряженных связей двух ионовых колец, соединенных углеводородной цепочкой, содержащей систему сопряженных двойных связей.
Реактивы: хлороформенный экстракт шиповника, бромная вода.
Порядок выполнения работы. К 5 каплям экстракта добавляют 2 капли бромной воды.
Раствор обесцвечивается. Почему? Дайте объяснение.
Опыт № 2 . Витамины группы Д (кальциферолы)
Название кальциферолы объединяет группу родственных соединений (производных стеролов), обладающих антирахиточным действием. Наиболее важны витамины Д2 (эргокальциферол) и витамин Д3 (холекальциферол). Витамины Д2 и Д3 образуются под действием солнечного света соответственно из эргостерина и дегидрохолестерина, которые содержатся в подкожной жировой клетчатке.
Наибольшее количество витамина Д3 содержится в продуктах животного происхождения: сливочном масле, желтки яиц, печени, жирах, рыбьем жире. Из растительных продуктов наиболее богаты витамином Д2 растительные масла (подсолнечное, оливковое и др.), много витамина Д2 в дрожжах, а витамина Д3 – в сырой капусте.
Реакция с анилином. Реактивы: рыбий жир, витамин Д (масляный экстракт); анилин; концентрированная соляная кислота.
Порядок выполнения работы. Берут две пробирки, в одну вносят 2–4 капли рыбьего жира (содержит витамин Д3), а в другую – 2 капли масляного раствора витамина Д, содержащего витамин Д2 (получаемого путем облучения эргостерола дрожжей). В каждую пробирку добавляют 2–4 капли анилина и по 1 капле концентрированной соляной кислоты. Перемешивают и осторожно нагревают почти до кипения.
При наличии витамина Д желтая эмульсия делится на два слоя, из которых нижний окрашен в интенсивный красный цвет.
Бромхлороформная проба.
Реактивы: рыбий жир, витамин Д масляный раствор; раствор брома в хлороформе (1:60).
Порядок выполнения работы. В сухую пробирку наливают 5 капель рыбьего жира и 5 капель раствора брома в хлороформе. В присутствии витамина Д возникает зеленовато-голубое окрашивание.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 22. ВОДОРАСТОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
В настоящее время коферментная роль доказана для многих водорастворимых витаминов: В1, В2, В6, B12, PP, фолиевой кислоты, биотина и т. д.
Опыт №1. Определение витамина В2
Витамин В2 (рибофлавин, лактофлавин) принимает участие в окислительно-восста-новительных процессах в организмах.
В основе молекулы рибофлавина лежит гетероциклическое соединение – изоаллоксазин (сочетание бензольного, пиразинового и пиридинового оснований). Витамин В2 представляют собой оранжевые кристаллы в форме игл, Тпл. 282 оС.
Рибофлавин хорошо растворим в воде, устойчив в кислых растворах, но легко разрушается в нейтральных и щелочных растворах. Растворы витамина В2 ярко-желтого цвета, характеризующиеся желто-зеленой флуоресценцией.
Источником витамина В2 являются молоко, зеленые овощи, печень, почки животных, дрожжи.
Реактивы: 0,015 % раствор рибофлавин; концентрированная соляная кислота; цинк металлический.
Порядок выполнения работы. К 1 мл раствора рибофлавина добавляют 10 капель соляной кислоты и кусочек цинка. Под влиянем выделяющегося водорода окраска постепенно меняется: из жёлтой сначала превращается в зелёную, затем в малиновую, розовую, и, наконец, обесцвечивается. Через несколько минут верхний слой жидкости в пробирке снова принимает желтое окрашивание.
Протекающий процесс можно выразить уравнением:
Почему растворы рибофлавина окрашенные? Что происходит
при проведении данного опыта? Дайте объяснение.
Опыт №2. Определение витамина В6
Витамин B6 (пиридоксин, адермин)/Наилучшими источниками витамина В6 служат: хлеб, горох, фасоль, картофель, мясо, печень.
Термин «витамин B6» применяется ко всем трем производным 3- гидроксипиридинам, обладающим витаминной активностью:
Реактивы и материалы: 1 % раствор витамина B6; 1% хлорного железа.
В пробирке смешивают по 2 капли раствора витамина В6 и по 2 капли раствора хлорного железа. Появляется красная окраска.
Опыт №3. Определение виатмина С.
Витамин С (аскорбиновая кислота) – группа природных соединений, производных L-гулоновой кислоты. Наиболее важнейшие представители: L-аскорбиновая и L-дегидроаскорбиновая кислота.
Биологическая роль витамина С связана с его участием в окислительно-восстановительных процессах. Аскорбиновая кислота – один из наиболее широко распространенных в природе витаминов.
Основные источники витамина С – продукты растительного происхождения, (лимоны, черная смородина, шиповник, облепиха, помидоры) Основная функция витамина С – поддерживать сопротивляемость организма инфекционным заболеваниям.
Витамин С представляет собой бесцветные кристаллы (Т пл. = 192 °С), кислые на вкус, хорошо растворимые в воде и спирте. Аскорбиновая кислота устойчива в сухом виде в темноте. В водных растворах, особенно в щелочной среде, быстро окисляется обратимо до дегидроаскорбиновой кислоты:
На способности аскорбиновой кислоты при окислении легко восстанавливать многие соединения (йод, хлорид железа(III) , нитрат серебра, 2,6-дихлорфенолиндофенолы, метиленовую синь) основаны реакции качественного обнаружения витамина С.
Реактивы: витамин С (сок капусты или картофеля); 0,05 % раствор аскорбиновой кислоты; раствор Люголя; 5 % раствор гексацианоферрата (III) калия (железосинеродистый калий); 1 % раствор хлорида железа(III); 10 % раствор соляной кислоты; 5 % раствор нитрата серебра.
Порядок выполнения работы.
1. В пробирке смешивают по 2 капли раствора аскорбиновой кислоты (сок капусты или картофеля) и раствор Люголя. Наблюдается обесцвечивание раствора. Напишите уравнение реакции.
2. К 3 каплям раствора аскорбиновой кислоты (или сока овощей) добавляют 1 каплю раствора нитрата серебра. Выпадает темносиний осадок металлического серебра. В отличие от углеводов витамин С восстанавливает серебро без добавления щелочи. Напишите уравнение реакции.
3. К 1 мл сока капусты (или раствора аскорбиновой кислоты) прибавляют 2 капли раствора гидроксида калия, 2 капли раствора гексацианоферрата (III) калия и энергично встряхивают содержимоепробирки. Затем в пробирку добавляют 6–8 капель раствора соляной кислоты и 1–2 капли раствора хлорида железа (III), выпадает синий (или зеленовато-синий) осадок берлинской лазури.
Реакции протекают по схеме:
Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавливает гаксациано(III) феррат калия до гексациано-(II) феррата калия, который с ионом железа в степени окисления +3, образует в кислой среде гаксациано-(III)-феррат железа (берлинскую лазурь):
3 K4[Fe (CN)6] + 4 FeCl3 → Fe4[Fe (CN)6]3 + 12 KCl.
Опыт 4 Определение витамина Р.
Витамин Р (цитрин, рутин, витамин проницаемости).
Известно несколько соединений обладающих активностью витамина Р. В основе их молекул лежит скелет природного соединения флавона:
Многие из этих веществ имеют один или несколько фенольных гидроксильных групп в положениях 5, 7, 3, 4. Наличием фенольных групп объясняется способность флавоновых производных образовывать цветные комплексные соединения с некоторыми металлами.
Существует тесная функциональная связь витаминов С и Р в окислительно-восстановительных процессах. Комплекс витамина С и флавоноидов называют аскорутин.
Основными источниками витамина Р являются растительные продукты питания (овощи, фрукты), в которых содержится много витамина С. В листьях чайного дерева содержатся производные флавона, называемые катехинами.
Реакция с хлоридом железа (III)
Реактивы и материалы: насыщенный водный раствор рутина; 01 % раствор хлорида железа (III).
Порядок выполнения работы. К 1–2 мл насыщенного раствора рутина прибавляют 3–5 капель раствора хлорида железа (III). Появляется зеленое окрашивание (изумрудно-зеленый цвет). Хлорид железа (III) образует с рутином комплексное соединение за счет координационных связей между ионом железа и атомами кислорода фенольных групп молекулы рутина.
Реакция с концентрированной серной кислотой
Концентрированная серная кислота образует с флавонами и флавоноидами оксониевые (флавилиевые) соли, растворы которых характеризуются ярко-желтой окраской.
Реактивы и материалы: насыщенный водный раствор рутина; концентрированная серная кислота.
Порядок выполнения работы.
К 5 каплям насыщенного водного раствора рутина осторожно по стенке пробирки добавляют 5 капель концентрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо.
Опыт №5. Обнаружение катехинов в чае.
Реактивы: листочки сухого чая; 2,5 % раствор молибденово-кислого аммония, 1 % спиртовой раствор хлорида железа (III); 95 % этиловый спирт.
Порядок выполнения работы. В сухую пробирку помещают несколько кусочков чая и заполняют спиртом до 1/3 объема пробирки. Встряхивают до тех пор, пока спирт не окрасится в зеленоватожелтый цвет. Полученный экстракт, содержащий катехины чая, отделяют фильтрованием и проделывают с ними следующие реакции:
1) К 5 каплям экстракта добавляют по каплям спиртовой раствор хлорида железа (III) – возникает оливково-серое, оливковое или зеленое окрашивание. Почему? Дайте объяснение.
2) К 5 каплям спиртового экстракта добавляют 1 каплю раствора молибденовокислого аммония – появляется красное окрашивание, переходящее при разбавлении раствора спиртом в оливковое или желто-зеленое.
Вопросы для проверки полученных знаний.
1. Что входит в понятие «витамины»
2. Классификация витаминов.
3. Биологическая роль витаминов.
4. Главные источники витаминов в природе.
5. Привести примеры водорастворимых витаминов. Их химиче-
ское строение.
6. Качественные реакции на водорастворимые витамины.
7. Качественные реакции на жирорастворимые витамины.