Окисление и восстановление органических веществ

Повышенная склонность органических соединений к окислению обусловлена наличием в молекуле веществ:

• кратных связей (именно поэтому так легко окисляются алкены, алканы, алкадиены);

• определенных функциональных групп – сульфидной -SH, гидроксильной –OH (фенольной и спиртовой), аминной - NH ;

• активированных алкильных групп, расположенных по соседству с кратными связям, например пропен может быть окислен до непредельного альдегида акролеина (кислородом воздуха в присутствии водяных паров на висмут- молибденовых катализаторах):

• атомов водорода при атоме углерода, содержащем функциональную группу.

Сравним первичные, вторичные и третичные спирты по реакционной способности к окислению:

Первичные и вторичные спирты, имеющие атомы водорода при атоме углерода, несущем функциональную группу; окисляются легко: первые – до альдегидов, вторые до кетонов. При этом структура углеродного скелета исходного спирта сохраняется. Третичные спирты, в молекулах которых нет атома водорода при атоме углерода, содержащем групп ОН^–, в обычных условиях не окисляются. В жестких условиях (при действии сильных окислителей и при высоких температурах) они могут быть  окислены  до смеси низкомолекулярных карбоновых кислот, т.е. происходит деструкция углеродного скелета.

Существуют два подхода к определению степеней окисления элементов в органических веществах.

1. Вычисляют среднюю степень окисления атома углерода в молекуле органического соединения, например пропана.

С₃^-8/3Н₈⁺¹

Такой подход оправдан, если в ходе реакции в органическом веществе разрушаются все химические связи (горение, полное разложение).

Отметим, что формально дробные степени окисления, вычисленные таким образом, могут быть и в случае неорганических веществ. Например, в соединении КО₂ (надпероксида калия) степень окисления кислорода равна – 1/2.

2. Определяют степень окисления каждого атома углерода, например в бутане.

Н₃⁺¹С^-3–С^-2Н₂⁺¹– С^-2Н₂⁺¹–С^-3Н₃⁺¹

В этом случае степень окисления любого атома углерода в органическом соединении равна алгебраической сумме чисел всех связей с атомами более электроотрицательных элементов, учитываемых со знаком «+», и числа связей с атомами водорода (или другого более электроположительного элемента), учитываемых со знаком «-». При этом связи с атомами углерода не учитывают.

В качестве простейшего примера определим степень окисления углерода в молекуле метанола.

С^-2Н₃⁺¹–ОН

Атом углерода связан с тремя атомами водорода (эти связи учитываются со знаком «-»), одной связью – с атомом кислорода (ее учитывают со знаком «+»). Получаем:

-3 + 1 = -2

Таким образом, степень окисления углерода в метаноле равна -2.

Вычисленная степень окисления углерода хотя и условное значение, но оно указывает на характер смещения электронной плотности в молекуле, а ее изменение в результате реакции свидетельствует об имеющем место окислительно-восстановительном процессе.

Рассмотрим цепочку превращений веществ:

При каталитическом дегидрировании этана получается этилен; продукт гидратации этилена – этанол; его окисление приведет к этаналю, а затем – к уксусной кислоте; при ее сгорании образуется углекислый газ и вода.

Определим степени окисления каждого атома углерода в молекулах перечисленных веществ.

Можно заметить, что в ходе каждого из этих превращений постоянно меняется степень окисления одного из атомов углерода. В направлении от этана к оксиду углерода (IV) происходит увеличение степени окисления атома углерода.

Несмотря на то, что в ходе любых окислительно-восстановительных реакций происходит как окисление, так и восстановление, их  классифицируют в зависимости оттого,  что происходит непосредственно с органическим соединением (если оно окисляется, говорят о процессе окисления, если восстанавливается – о процессе восстановления).

Так, в реакции этанола с перманганатом калия этанол будет окисляться, а перманганат калия – восстанавливается. Реакцию называют окислением этанола.

Вопросы для проверки полученных знаний.

1. Современные представления о кислотах и основаниях Бренстеда и Лоури.

2. .Зависимость кислотности от гетероатома.

3. Влияние углеводородного радикала и присутствующих в нем заместителей.

4. Влияние растворителя.

5. Основные свойства органических соединений. π-основания и n-основания.

6. Основность органических соединений.

7. Теория Льюиса.

8. Кислотами Льюиса.

9. Основаниями Льюиса.

10. Радикальные и электрофильные реакции углеводородов и их производные.

11. Реакции радикального замещения (SR).

12. Реакции электрофильного присоединения.

13. Классическое правило Марковникова.

14. Нуклеофильные реакции.

15. Моно- и бимолекулярное нуклеофильное замещение и отщепление.

16. Окисление и восстановление органических веществ.

17. Определение степеней окисления элементов в органических веществах.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4.

ИЗУЧЕНИЕ КИСЛОТНО-ОСНОВНЫХ СВОЙСТВ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Цель: изучить и сравнить кислотно-основные свойства некоторых представителей спиртов и аминов.

Опыт 1. Получение этоксида натрия и его гидролиз

В сухую пробирку поместите 10 капель этанола и внесите кусочек металлического натрия размером половины рисового зернышка, предварительно отжатого от керосина на фильтровальной бумаге. Соберите выделяющийся водород, прикрыв пробирку пробкой. Затем поднесите пробирку отверстием к пламени горелки. Смесь водорода с воздухом сгорает с характерным «лающим» звуком. Выпавший белый осадок этоксида натрия растворите в 2-4 каплях этанола и добавьте 1 каплю 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина. Наблюдается ли окрашивание? После этого внесите в пробирку 1–2 капли воды. Объясните появление малиновой окраски раствора.

Вопросы

1. Напишите схемы реакций получения этоксида (этилата) натрия и его гидролиза.

2. Какое свойство спиртов проявляется в реакции с натрием?

3. Можно ли с помощью цветных индикаторов обнаружить кислотные свойства этанола?

4. Почему спирты реагируют с натрием медленнее, чем вода?

5. Почему вода разлагает этилат натрия?

Опыт 2. Получение этиленгликолята меди (II)

При взаимодействии гидроксида меди (II) с этиленгликолем образуется гликолят меди, раствор которого имеет синюю окраску. Эта реакция используется для обнаружения органических соединений, содержащих диольный фрагмент, т.е. гидроксильные группы у двух соседних атомов углерода.

В пробирку внесите 2 капли 2 %-ного раствора сульфата меди (II) и 2 капли 10 %-ного раствора гидроксида натрия. Образуется голубой хлопьевидный осадок гидроксида меди (II) Сu(OH)_2.

Добавьте к нему 1 каплю этиленгликоля и встряхните пробирку.

Вопросы

1. Напишите схему реакции взаимодействия этиленгликоля с гидроксидом меди (II) с образованием хелатного комплекса гликолята меди (II).

2. Какой структурный фрагмент содержат органические соединения, растворяющие гидроксид меди (II)?

Опыт 3. Получение феноксида натрия и разложение его кислотой

В пробирку с 3 каплями воды поместите несколько кристалликов фенола и встряхните. К возникшей мутной эмульсии добавляйте по каплям 10 %-ный раствор гидроксида натрия до образования прозрачного раствора. Подкислите этот раствор несколькими каплями 10 %-ного раствора соляной кислоты.

Вопросы

1. Напишите схему реакции получения феноксида (фенолята) натрия.

2. Почему фенол в отличие от спиртов способен взаимодействовать со щелочами?

3. В чем причина большей кислотности фенола по сравнению со спиртами?

4. Почему при добавлении соляной кислоты к раствору фенолята натрия наблюдается помутнение раствора? Напишите схему происхождения реакции.

5. Почему фенолят натрия не разлагается водой?

Опыт 4. Получение солей аминов

А) В две пробирки внесите по 2 капли воды. Затем в 1-ю пробирку поместите 1 каплю анилина, а во 2-ю – 1 каплю диэтиламина и взболтайте. Сравните растворимость этих аминов в воде. По 1 капле содержимого каждой пробирки нанесите на полоску универсальной индикаторной бумаги или красного лакмуса. По окраске ориентировочно определите pHрастворов анилина и диэтиламина.

Б) К эмульсии анилина в воде добавьте 1 каплю 10 %-ного раствора хлороводородной кислоты. Образуется прозрачный раствор. К раствору диэтиламина прибавьте 3 капли насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и перемешайте. Пробирку поместите в стакан с холодной водой. Через некоторое время выпадает осадок пикрата диэтиламина.

Вопросы

1. Сравните основность диэтиламина и анилина.

2. Почему при добавлении к эмульсии анилина хлороводородной кислоты раствор становится прозрачным? Напишите схему происходящей реакции.

3. Напишите схему реакции взаимодействия диэтиламина с пикриновой кислотой (2,4,6-тринитрофенолом).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5 . ЭЛЕКТРОФИЛЬНОЕ ЗАМЕЩЕНИЕ В АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЯХ

Для ароматических соединений бензольного ряда, конденсированных и гетероциклических ароматических соединений характерны реакции, не приводящие к нарушению ароматической системы, т.е. реакции замещения. Они не склонны вступать в реакции присоединения или окисления, ведущие к нарушению ароматичности. По этой причине при окислении гомологов бензола, пиридина и других ароматических соединений в мягких условиях (например, при нагревании с перманганатом калия в щелочной среде или дихроматом калия в серной кислоте) окисляются только боковые углеводородные радикалы.

Цель: изучить химические свойства ароматических соединений.

Опыт 1. Бромирование анилина

Реакция бромирования анилина протекает с высоким выходом и используется в фармацевтическом анализе для открытия анилина и ряда его производных.

В пробирку поместите 3 капли анилина и 10 капель воды, хорошо взболтайте и прибавьте несколько капель бромной воды до появления белого осадка 2,4,6-триброманилина.

Вопросы

1. Напишите схему реакции бромирования анилина.

2. Объясните активирующее и ориентирующее влияние аминогруппы в молекуле анилина.

Опыт 2. Сульфирование нафталина

Нафталин применяется как инсектицид, в производстве синтетических красителей, искусственных смол, взрывчатых веществ. Препараты, содержащие нафталин, при воздействии на кожу и слизистые оболочки оказывают рассасывающее, дезинфицирующее и некоторое болеутоляющее действие. В виде мазей и эмульсий их применяют при заболеваниях кожи.

-нафталинсульфокислоты. В сухую пробирку поместите 1 лопаточку нафталина. Нагрейте пробирку до расплавления нафталина. После остывания пробирки добавьте к затвердевшему нафталину 10 капель концентрированной серной кислоты (в вытяжном шкафу). Осторожно нагрейте пробирку над пламенем горелки, постоянно встряхивая до достижения полной однородности смеси. После остывания смеси добавьте к ней 10 капель воды и снова слегка нагрейте. При охлаждении выделяются кристаллы

Вопросы

1. Напишите схему реакции сульфирования нафталина, учитывая, что в условиях опыта сульфирование происходит при температуре 140-190°С.

2. Какой продукт образуется при сульфировании нафталина при температуре 80 ⁰С?

3. На примере реакции сульфирования нафталина объясните, в чем состоит сущность кинетически и термодинамически контролируемых реакций.

Опыт 3. Окисление боковых цепей гомологов бензола

В результате окисления любой углеводородный радикал в ароматическом кольце независимо от длины углеродной цепи образует карбоксильную группу, связанную с ароматическим кольцом. Поэтому с помощью реакций окисления устанавливают наличие и положение боковых цепей в ароматических углеводородах.

В пробирку поместите 5 капель воды, 3 капли 2 %-ного раствора перманганата калия и 1 каплю 10 %-ного раствора серной кислоты. Добавьте 1-2 капли толуола и, энергично встряхивая, нагрейте пробирку над пламенем горелки. Отметьте, какие изменения произошли с окраской раствора.

Вопросы

1. Напишите схему реакции окисления толуола. Назовите продукт реакции.

2. Напишите схему реакции окисления 1-метил-2-этилбензола. Назовите продукт реакции.

3. В результате окисления гомолога бензола получена бензол-1,4-дикарбоновая (терефталевая) кислота. В каком положении находились алкильные группы в исходном соединении?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6 .РЕАКЦИИ НУКЛЕОФИЛЬНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ И ЭЛИМИНИРОВАНИЯ У НАСЫЩЕННОГО АТОМА УГЛЕРОДА

Опыт 1 Получение хлорэтана из этанола.

В данной реакции используется кислотный катализ для перевода гидроксильной группы в хо­рошо уходящую ониевую группу. В организме гидроксильная группа замещается только по­сле превращения ее в эфиры фосфорной, дифосфорной и трифосфорной кислот.

Ход работы: в пробирку поместите 6-7 капель этилового спирта и добавьте 1 лопаточку хло­рида натрия. Хорошо перемешайте содержимое и прибавьте (в вытяжном шкафу) 2 - 3 капли концентрированной серной кислоты. Нагревайте на слабом пламени горелки и периодически подносите отверстие пробирки к пламени. Полученный хлорэтан загорается с образованием зеленого дыма.

В выводе отметьте:

1. Напишите уравнение реакции получения этилхлорида, с указанием механизма реакции.

2. Какую роль играет в данной реакции серная кислота?

Опыт №2 Дегидратация этанола.

Реакции дегидратации играют важную роль в процессах метаболизма биологически важных соединений: углеводов, жирных кислот.

Ход работы: Приготовьте 3 пробирки.

№ пробирки	Компоненты	Количество
I	H2SO4 (конц.) С2Н5ОН Al2O3	7-8 капель 4-5 капель 5-6 кристаллов
II	Вг2 вода	5 -6 капель
III	2% - раствор КМnО4 Н2О	1 капля 5-6 капель

Закройте 1-ю пробирку пробкой с газоотводной трубкой, которую опустите во 2-ю пробирку. Нагревайте 1-ю пробирку на слабом пламени горелки, когда бромная вода обесцветится, бы­стро опустите газоотводную трубку в 3-ю пробирку. После того, как раствор перманганата калия обесцветится, подожгите выделяющийся газ у конца газоотводной трубки. Газ горит светящимся пламенем.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7. РЕАКЦИИ НУКЛЕОФИЛЬНОГО ПРИСОЕДИНЕНИЯ В АЛЬДЕГИДАХИ КЕТОНАХ

Цель:изучить и сравнить свойства карбонильных соединений – альдегидов и кетонов.

Опыт 1. Получение оксима ацетона

Многие оксимы хорошо кристаллизуются и имеют четко выраженную температуру плавления, поэтому они используются для идентификации карбонильных соединений.

В пробирку поместите по 1 лопаточке гидрохлорида гидроксиламина и сухого карбоната натрия, растворите в 10-20 каплях воды. После выделения основной массы диоксида углерода охладите пробирку и добавьте при встряхивании 15 капель ацетона.

Вопросы

1. Какие изменения наблюдаются в пробирке?

2. Напишите схему происходящей в пробирке реакции и приведите ее механизм.

Опыт 2. Получение 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида

Поместите в пробирку 5 капель раствора 2,4-динитрофенилгидразина и 1-2 капли формалина.

Вопросы

1. Какие изменения наблюдаются в пробирке?

2. Напишите схему происходящей реакции и приведите ее механизм.

3. Будут ли вступать в эту реакцию кетоны?

Опыт 3. Цветные реакции на альдегиды и кетоны

Реакции являются очень чувствительными, широко используются в клиническом анализе (например, для обнаружения ацетона в моче).

А) В пробирку поместите 2-3 капли формалина и 2 капли раствора фуксинсернистой кислоты.

Б) Иодоформная проба (проба Либена).

Данная реакция имеет практическое значение для диагностики сахарного диабета, при котором наблюдается повышенное содержание "кетоновых тел" (ацетона, ацетоацетата, β-гидроксибутирата) в крови и моче.

Ход работы: В пробирку поместите 1 каплю раствора йода в йодиде калия и добавьте по каплям 10% - раствор гидроксида натрия до обесцвечивания интенсивной окраски йода. Прибавьте 1 каплю ацетона и нагрейте на слабом пламени горелки. При этом образуется муть, а затем осадок йодоформа желтого или желтовато-белого цвета с характерным запахом.

Вопросы

1.Напишите реакцию образования йодоформа.

2. Какие соединения можно обнаружить с помощью йодоформной пробы?

3. Возможно ли обнаружить этанол с помощью иодоформной пробы?

Опыт 4. Окисление карбонильных соединений

А) окисление формальдегида аммиачным раствором гидроксида серебра (реакция серебряного зеркала, качественная реакция на альдегиды)

В чистую сухую пробирку налейте 1 мл свежеприготовленного аммиачного раствора оксида серебра и 1 мл формалина (осторожно по стенке). Полученную смесь поместите в горячую водяную баню.

Б) окисление формальдегида гидроксидом меди (II)

В пробирку налейте 2 мл 5 %-ного раствора формальдегида (формалин), 2 мл 10 %-ного раствора гидроксида натрия и, при встряхивании, добавьте по каплям 2 %-ный раствор сульфата меди (II) до появления неисчезающего осадка. Содержимое пробирки нагрейте до начала кипения и наблюдайте изменение окраски реакционной смеси.

Вопросы

1. Какие изменения наблюдаются в пробирках после нагревания?

2. Напишите схему окисления формальдегида по реакции серебряного зеркала и с гидроксидом меди (II).

3. Можно ли использовать как качественную пробу реакцию серебряного зеркала для кетонов?

в)окисление ацетона

Ацетон не может быть окислен в условиях окисления альдегидов (почему?), но он может быть окислен более сильным окислителем.

В пробирку к 1 мл ацетона прилейте 1 мл воды (растворяется ли ацетон в воде?). К полученному раствору добавьте 1-2 капли концентрированной серной кислоты. Подогрейте пробирку на горячей водяной бане и внесите небольшими порциями измельчённый перманганат калия, пока не перестанет исчезать его фиолетовая окраска. При нагревании раствора можно обнаружить по запаху пары уксусной кислоты.

При окислении происходит разрыв углеродной цепи и образование двух кислот – уксусной и муравьиной.

Вопросы

1. Чем объясняется различие в способности к окислению альдегидов и кетонов?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8

.РЕАКЦИИ НУКЛЕОФИЛЬНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ В КАРБОНОВЫХ КИСЛОТАХ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Опыт 1. Открытие уксусной кислоты

Уксусная кислота оказывает бактерицидное и бактериостатическое действие. Например, 3 %-ный раствор уксусной кислоты убивает палочки брюшного тифа, 4 %-ный раствор – кишечную палочку. Особенно активна уксусная кислота по отношению к стафилококкам, служащим причиной пищевых отравлений.

В пробирку поместите по 3 капли уксусной кислоты и воды. Испытайте реакцию раствора на лакмус. К раствору прибавьте 2-3 капли 10 %-ного раствора гидроксида натрия до полной нейтрализации уксусной кислоты. После этого добавьте 2-3 капли 1 %-ного раствора хлорида железа (III). Появляется желто-красное окрашивание за счет образования ацетата железа (III).

Подогрейте раствор до кипения. Выделяется красно-бурый осадок не растворимого в воде гидроксида диацетата железа. Раствор над осадком становится бесцветным.

Вопросы

1. Напишите схему реакции диссоциации уксусной кислоты. Как подтвердить этот процесс экспериментально?

2. Напишите схему реакции взаимодействия уксусной кислоты с гидроксидом натрия. Как экспериментально определить момент нейтрализации уксусной кислоты?

3. Напишите схему реакции образования ацетата железа (III).

4. Напишите структурную формулу гидроксида диацетата железа (III).

Опыт 2 Качественная реакция на щавелевую кислоту.

Данная реакция находит применение при клиническом исследовании мочи. Кристаллы оксалата кальция появляются в моче человека при некоторых патологических состояниях. Кри­сталлы плохо растворимы в воде и обладают характерной формой (в виде почтовых конвер­тов).

Ход работы: В пробирку поместите, порошок щавелевой кислоты (высота 5 мм) и несколько капель воды до полного растворения. Затем нанесите 1 каплю испытуемого раствора на предметное стекло и прибавьте 1 каплю раствора хлорида кальция. Образуется кристаллический осадок.

Вопросы

Опыт 2. Образование нерастворимых кальциевых солей высших жирных кислот

В пробирку поместите 5 капель раствора мыла и добавьте 1 каплю раствора хлорида кальция. Взболтайте содержимое пробирки, появляется белый осадок.

Вопросы

1.Напишите уравнение реакции образования оксалата кальция.

Опыт 3 Образование нерастворимых солей высших жирных кислот.

Ход работы: В пробирку последовательно поместите 5-6 капель раствора мыла и 1 - 2 капли рас­твора хлорида кальция. Хорошо перемешайте содержимое пробирки до образования белого осадка.

В выводе отметьте:

1. Напишите уравнение реакции образования кальциевой соли стеариновой кислоты.

2. Какие соединения называют мылами?.

3. В состав каких биологически важных соединений входят высшие жирные кислоты?

Опыт 4 Открытие этилового спирта реакцией образования уксусно-этилового эфира.

Ход работы: В пробирку поместите половину лопаточки порошка безводного ацетата натрия и 4 капли этанола. Добавьте 3 капли концентрированной серной кислоты и осторожно на­грейте смесь до кипения. Через несколько секунд появляется характерный приятный запах этилацетата.

Вопросы

1. Напишите уравнение реакции образования этилацетата с указанием механизма.

2.Какова роль концентрированной серной кислоты в реакции этерификации?

Опыт 5. Гидролиз этилацетата

Поместите в две пробирки по 5 капель этилацетата и воды. Затем в 1-ю пробирку прибавьте 1 каплю концентрированной серной кислоты, во 2-ю – 7 капель 10 %-ного раствора гидроксида натрия. Обе пробирки нагрейте при энергичном встряхивании. Реакционная смесь становится однородной.

Вопросы

1. Чем объясняется полное исчезновение запаха этилацетата во 2-й пробирке? Напишите схему происходящей реакции.

2. Почему в 1-й пробирке сохраняется запах этилацетата? Напишите схему реакции гидролиза этилацетата в кислой среде.

Опыт 6. Декарбоксилирование щавелевой кислоты

В сухую пробирку поместите 2-3 лопаточки щавелевой кислоты. Пробирку закройте пробкой с газоотводной трубкой и нагрейте. Конец газоотводной трубки опустите в другую пробирку, содержащую 5-10 капель известковой воды.

Вопросы

1. Напишите схему реакции, происходящей при нагревании щавелевой кислоты.

2. Какое изменение наблюдается в пробирке с известковой водой?

3. Почему проделанный опыт можно использовать для обнаружения щавелевой кислоты?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ ЖЕЛАТИНЫ

В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы. Молекулы белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. Выпадение белка в осадок можно ускорить добавлением водоотнимающих веществ, например, этилового спирта.

Желатина (желатин) – полидесперсная смесь полипептидов (молекулярная масса–50–70 тыс. Д), образуемая из коллагена.

Реактивы:0,5 %-й раствор желатины;0,1 М раствор уксусной кислоты;0,1 М раствор ацетата натрия; 96 %-й этиловый спирт.

Оборудование:пробирки; мерные пипетки.

Ход работы

1. В пять пронумерованных пробирок прилейте растворы уксусной кислоты и ацетата натрия в количествах, указанных в таблице.

2. После чего в каждую пробирку добавьте по 1 см³раствора желатины и хорошо перемешайте.

3. В каждую пробирку прибавьте по 4 см³этилового спирта и снова перемешайте.

4. Через 5–10 мин. просмотрите все пробирки и оцените степень мутности полученных смесей.рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатины.

Оформление результатов

Результаты опыта оформите в виде таблицы. Определите изоэлектрическую точку желатины.

№ про-ббирки	Состав буферной смеси, см3			рН смеси		0,5 %-й раствор желатины, см3		Этиловый спирт, см3		Степень мутнсти  (по 5 балльной шкале)
	0,1 М СH3COOH	0,1 M СH3COONa
	1,8	0,2	3,8		1		4
	1,4	0,6	4,4		1		4
	1,0	1,0	4,7		1		4
	0,6	1,4	5,1		1		4
	0,2	1,8	5,7		1		4

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 10. ОКИСЛЕНИЕ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ В МОЛЕКУЛАХ ОРГАНИЧЕСКИХСОЕДИНЕНИЙ.

Опыт 1 Определение доброкачественности диэтилового эфира.

При хранении, особенно на свету простые эфиры медленно окисляются кислородом воздуха с образованием пероксидов, гидропероксидов и альдегидов. Это свойство необходимо учитывать при работе, т.к. некоторые эфиры, например диэтиловый, используются в фармацевтической и медицинской практике (для наркоза). Учитывая взрывоопасность пероксидов и гидр­пероксидов необходимо всегда проверить их на наличие пероксидных соединений. Проба на наличие пероксидов проводится с йодидом калия. Если в эфире содержатся пероксиды, то они окисляют йодид калия до свободного йода, окрашивающего раствор в буро-коричневый цвет. Для разрушения пероксидных соединений эфир обрабатывают раствором щелочи или восстановителей - сульфита натрия, сульфата железа (II) и др.

Пробу на ацетальдегид проводят с фуксинсернистой кислотой.

Ход работы: В две пробирки поместите по 3 - 4 капли диэтилового эфира. В первую пробирку добавьте 2 капли 10% - раствора йодида калия и 2 капли 10% раствора соляной кислоты, при наличии пероксидов раствор окрашивается в буро-коричневый цвет. Если окраска слабая, то добавьте 1 каплю 0,5% - крахмального клейстера. Появляется синее окрашивание (йодо-крахмальная проба). Во вторую пробирку прибавьте 2-3 капли фуксин-сернистой кислоты. При наличии ацетальдегида появляется розовое окраши­вание.

В выводе отметьте:

-какая реакция применяется для открытия пероксидных примесей в диэтиловом эфире?

- напишите уравнение реакции

Опыт 2 Окисление олеиновой кислоты.

Ход работы: В пробирку поместите 1-2 капли олеиновой кислоты и 1 - 2 капли 5% - раствора карбоната натрия. Добавьте 1 - 2 капли 2% - раствора перманганата калия. Раствор окрашивается в буро-коричневый цвет.

В выводе отметьте:

- с какой целью используется реакция с раствором перманганата калия?

- напишите уравнение реакции окисления олеиновой кислоты.

Опыт 3 Окисление этилового спирта.

Ход работы: В пробирку поместите 2 капли этанола, 2 капли 5% - раствора дихромата калия и 1 каплю 10% - раствора серной кислоты. Полученный оранжевый раствор слегка нагрейте над пламенем горелки до начала изменения цвета. Обычно уже через несколько секунд появ­ляется зеленоватая окраска, характерная для хрома (III). Одновременно ощущается запах аце­тальдегида (запах прелых яблок).

В выводе отметьте:

- напишите уравнение реакции окисления этилового спирта в уксусный альдегид.

Опыт 4 Окисление боковых цепей гомологов бензола.

Ход работы: В пробирку поместите 3 капли 2% - раствора перманганата калия, 5 капель воды и 1 каплю 10% - раствора серной кислоты. Добавьте 1 каплю толуола и содержимое хорошо перемешайте, нагрейте смесь и отметьте изменение окраски.

В выводе напишите уравнение реакции окисления толуола.

Опыт 5. Определение внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона при окислительном стрессе.

Окислительным стрессом называют ситуацию, развивающуюся в клетках и тканях при повышении уровня окислителей и нарушении баланса антиоксидантных и прооксидантных факторов в пользу последних. Биологическими окислителями являются активные формы кислорода, в первую очередь кислородные свободные радикалы, а также активные формы азота и хлора. Свободными радикалами называют атомы или молекулы (частицы), несущие неспаренные электроны на внешних орбиталях.  Свободные радикалы парамагнитны, обладают высокой реакционной способностью.

Окислительный стресс во многом является следствием аэробного способа существования живых организмов. Молекулярный кислород необходим для аэробных организмов и одновременно потенциально токсичен. В течение 2∙10⁹ лет кислород служит основным акцептором электронов в биологических системах в процессах энергетического обмена. Электронная структура молекулы кислорода позволяет ему последовательно, с поглощением четырех электронов восстанавливаться до молекул воды через промежуточные частично восстановленные формы: супероксиданион О₂ –^.перекись водорода Н₂О₂, и наиболее активный гидроксильный радикал ОН^-. Высокая реакционная способность свободных радикалов (и окислителей нерадикальной природы) обуславливает их токсичность, связанную с неспецифическим повреждающим воздействием белки, нуклеиновые кислоты, липиды. Окислительная модификация белков и липидов существенно нарушает их структуру и функции. Ненасыщенные жирные кислоты липидов способны вступить в цепную радикальную реакцию пероксидации, включающую несколько стадий: инициации, разветвления, терминации. Цепное окислительное повреждение ненасыщенных цепей фосфолипидов сопровождается образованием гидропероксидов и поперечными сшивками ацильных цепей, что резко нарушает структуру и функции биологических мембран: разупорядочивание бислоя, возрастание проницаемости, формирование пор. Целый ряд патологий (в литературе сообщается о более чем 200) в той или иной мере связаны с развитием окислительного стресса. Одна из наиболее распространенных теорий старения – свободнорадикальная теория старения. Биохимические и физиологические повреждения, развивающиеся в клетке при окислительном стрессе, сопровождаются нарушениями клеточного метаболизма, смертью клетки. Свободные радикалы генерируются в клетках в процессах метаболизма (например, в цепи переноса электронов, в реакции фагоцитоза), при действии рентгеновского излучения, при метаболизме ксенобиотиков. Одновременно, свободные радикалы используются клетками как вторичные мессенджеры, участвуют в регуляции важнейших клеточных процессов.

В клетках существует сложная эффективная система антиоксидантной защиты, включающая несколько уровней:

1) компартментализация чувствительных клеточных элементов (например, ДНК),

2) удаление реактивных форм кислорода системой антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза,

3) изолирование ионов переходных металлов, например, ферритином,

4) связывание свободных радикалов низкомолекулярными компонентами клетками, клеточными тиолами, в первую очередь восстановленным глутатионом, токоферолом, аскорбиновой кислотой,

5) репарация повреждений,

6) инициация апоптоза.

Важнейшим низкомолекулярным антиоксидантом в клетке является глутатион, концентрация которого достигает 2 –10 мМв клеткак различных тканей. Впервые содержащее серу вещество выделил в1888 г. Де Рей–Пайад и  назвал «филотион». Глутатион, трипептид γ–глутамилцистеинглицин, существует в восстановленной (GSH) и окисленной (дисульфидной)(GSSG) формах. Его функции не вполне ясны, он выступает коферментом ряда ферментативных реакций, но основная его функция, защита клетки от окислительного электрофильного стресса.

Реактивы: эритроциты крысы, изотонический раствор хлористого натрия (0.15 М NaCl), реагент Эллмана: 5,5 – дитиобис (2–нитробензойная кислота) 5∙10^–3М, органический трет–бутилгидропероксид ТВООН  (100 мМ).

Оборудование: Спектрофотометр СФ–46 (ЛОМО), автоматические пипетки объемом 10 – 100 мкл и 200 – 1000 мкл, пробирки, спектрофотометрические кюветы, весы аналитические, центрифуга лабораторная.

Ход работы

1. Изолируем эритроциты крысы, проливая холодным (4  ⁰С) изотоническим раствором хлористого натрия (0,15 М NaCl). Эритроциты суспензируем в0,15 М NaCl из расчета 1 мл эритроцитов / 6 объемов раствора NaCl, осаждаем эритроциты центрифугированием: 1000 оборотов/мин, 5 минут. Процедуру повторяем 3 раза.

2.Готовим суспензию эритроцитов с 10 % гематокритом.

1) контрольный образец: 2 мл,

2) опытный образец: 2 мл,

3) проба сравнения: 2 мл0.15 Мраствора NaCl.

3. Подвергаем опытный образец окислительному стрессу, используя органический трет–бутилгидропероксид: ТВООН  к 2 мл суспензии эритроцитов (образец 2) прибавляем 20 мкл раствора ТВООН  (100 мМ), создавая концентрацию окислителя 1 мМ. Инкубируем образец при 22 ⁰С. Органический гидропероксид, взаимодействуя с ионами железа оксигемоглобина эритроцитов, образует алкоксильный ТВО^. и пероксильный ТВОО^. радикалам. Восстановленный глутатион в эритроцитах эффективно расходуется в реакциях детоксикации свободных радикалов, превращаясь в свою окисленную форму. Это происходит в реакции, катализируемой глутатион–пероксидазой (семейство селен–зависимых ферментов).

4. Для освобождения низкомолекулярных внутриклеточных компонентов разрушим клеточные мембраны и денатурируем белки клетки трихлоруксусной кислотой.

К образцам (1), (2) и (3) добавим 0.2 мл 20 % трихлоруксусной кислоты.

Для осаждения денатурированных белков и обрывков мембран подвергнем  образцы центрифугированию. Надосадочная жидкость прдставляет раствор кислотно–растворимых низкомолекулярных компонентов клетки.

5. Определим в надосадочной жидкости содержание  восстановленного глутатиона GSH.

Предварительно приведем значение рН среды к нейтральному. Для этого к 1 мл супернатанта (надосадочной жидкости) добавим 1 мл 0,5 Мнатрий–фосфатного буфера, рН 7,8.

Среди различных реагентов, используемых для специфического определения сульфгидрильных групп, наибольшую популярность приобрел реагент Эллмана: 5,5 – дитиобис (2–нитробензойная кислота)(Ellman, 1959), дисульфидное соединение. При рН 7.8–8.0 в реакциях с SH–группами реагент Эллмана образует окрашенный анион нитротиофенолята и смешанный дисульфид:

К 2 мл раствора добавим 30 мкл реактива Эллмана, концентрации 5∙10^–3М. Количество образующегося аниона нитротиофенолята численно равно количеству прореагировавших SH–групп, определяем количество аниона нитротиофенолята по специфическому поглощению при 412 нм, используя коэффициент молярной эксцинции ε = 13600 М^–1Тсм^–1. Описанный метод обладает высокой  чувствительностью и специфичностью.

6. Определим оптическую плотность образцов (1) и (2), используя образец (3) в качестве кюветы сравнения (это так называемая проба на реактивы, содержащая все реагенты за исключением определяемого глутатиона).

7. Рассчитаем концентрацию внутриклеточного восстановленного глутатиона с учетом гематокрита суспензии и внесенных реагентов (разбавление образца):

[GSH]=  Д⁴¹² / 13600 ∙10 ∙ 1,1 ∙2 ∙1,03

Опишите полученный результат и принципы метода.

Опыт 6. Обнаружение дегидрогеназ в семенах гороха

Дегидрогеназы – это ферменты, активирующие и отщепляющие водород от окисляемого субстрата. Обнаружение дегидрогеназ основано на их способности передавать водород какому-нибудь акцептору, который, восстанавливаясь, меняет свою окраску. В качестве акцептора водорода может быть взята метиленовая синь, переходящая в восстановленном состоянии в бесцветную лейкоформу.

Материал и объекты исследования: проросшие и покоящиеся семена гороха, пробирки, термостат с температурой 30-35°С, спиртовки, спички, держатели для пробирок, 1%-ный раствор метиленовой сини.

Ход работы: с семян набухшего гороха снять кожуру. Семена поместить в две пробирки. В одну из них налить воду и довести до кипения, чтобы убить ткани семян. После охлаждения воду слить и обе партии горошин (кипяченые и непрокипяченные) залить 1%-ным раствором метиленовой сини для окрашивания. Через 5–10 мин синь из пробирок слить, семена промыть водопроводной водой. После промывания все семена должны иметь темно-синюю окраску.

Окрашенные семена залить отстоянной водопроводной водой, пробирки закрыть резиновыми пробками, то есть создать анаэробные условия, и поместить их в термостат или водяную баню с оптимальной для работы дегидрогеназ температурой (около 30–35°С).

Через 1,5–2 ч можно заметить, что непрокипяченные семена теряют синюю окраску. Это происходит потому, что дегидрогеназы, участвующие в дыхании клеток, активировали и сняли водород с дыхательного материала, а затем передали его на метиленовую синь, которая восстановилась и обесцветилась. Если с обесцвеченных семян слить воду, то на воздухе они снова синеют, так как лейкоформа метиленовой сини окисляется.

Семена в контрольной пробирке остаются синими, поскольку при кипячении дегидрогеназы разрушились. Аналогичные опыты можно провести с любым неокрашенным растительным материалом. После проведения опыта зарисовать живые и мертвые семена, описать и объяснить полученный результат.

Опыт 7. Определение активности лактатдегидрогеназы

Лактатдегидрогеназа (L–лактат НАД оксидоредуктаза) относится к числу наиболее активных ферментов, осуществляющих окислительно–восстановительные превращения. Она катализирует реакцию

L–лактат+НАД⁺↔пируват+НАДН+Н⁺

При значениях pH, близких к нейтральным, равновесие реакции сдвинуто в сторону образования молочной кислоты и НАД⁺. Фермент выделен и кристаллическом виде из многих источников и довольно хорошо изучен. Молекулярная масса его около 140 тыс. Лактатдегидрогеназа — тетрамер, состоящий из 2 типов неидентичных субъединиц (H– и М–типа). Разные сочетания субъединиц объясняют существование 5 изоферментов, отличающихся по своим электрофоретическим и другим свойствам и по величинеKмдля субстратов. Изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в разных тканях различен, соотношение отдельных изоферментов может изменяться при экспериментальных воздействиях и патологии. Лактатдегидрогеназа локализована преимущественно в цитоплазматической фракции, однако в ряде тканей фермент обнаружен и на внешней мембране митохондрий. Доля митохондриального фермента в общей лактатдегидрогеназной активности ткани может достигать, например, в мозгу 5 – 7 %, в большинстве других тканей она не превышает 1 %.

Существует несколько методов определения активности лактатдегидрогеназы, основанных как на использовании естественных, так и искусственных акцепторов водорода. Основу данного определения составляет метод Бергмейера и соавт. (1965).

Принцип метода. Активность лактатдегидрогеназы оценивается по скорости окисления НАДН (уравнение приведено выше), которая регистрируется спектрофотометрически по убыли величины оптической плотности при длине волны 340 нм.

Реактивы:

1) 0,05 MК–фосфатный буфер (pН 7,5), содержащий 3·10^–4 моля пирувата (готовят перед экспериментом, растворяя навеску пирувата натрия в К–фосфатном буфере);

2) 9·10^–3 M раствор НАДН (готовят непосредственно перед проведением спектрофотометрического анализа).

Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением.

Ход работы

Навеску ткани печени или мозга массой 200 мг гомогенизируют при температуре 4 ºС с 1,8 мл охлажденной средой выделения:0,25 Мраствор сахарозы, содержащий1 мМЭДТА рН 7,4 (разведение 1:9, т.е 10 % гомогенат). Полученный гомогенат центрифугируют 15 минут при14000 g, в супернатанте определяют активность фермента.

В кювету спектрофотометра (1 см) наливают инкубационную среду, состоящую из 3,0 мл К–фосфатного буфера, содержащего пируват, и 0,05 мл раствора НАДН. Затем вводят 0,1 мл образца, содержащего фермент (гомогенат ткани, цитоплазматическая фракция или суспензия митохондрий), быстро перемешивают и измеряют исходную величину оптической плотности (Е₁). Регистрацию показаний спектрофотометра проводят с интервалом 30 св течение 3–5 минут рассчитывают среднее значение изменения оптической плотности пробы за 1 мин  (ΔЕ).

Лактатдегидрогеназа — очень активный фермент, поэтому предварительно необходимо подобрать соответствующее разведение анализируемых образцов (30 – 50 раз). Например, цитоплазматическую полученную из 10 %–го гомогената печени крыс после осаждения ядер и митохондрий, следует разнести (бидистиллированной водой – или К–фосфатнымбуфером) в 30–50 раз. Оптимальное разведение препарата такое, при котором ΔЕ/мин при длине полны 340 нм составляет 0,040 – 0,080.

Расчет

Активность лактатдегидрогеназы (в мкмолях НАДН/мин наа 1 мг белка) вычисляют по формуле:

X=ΔEV/6,22a (мкмоль НАДН/мин на 1 мг белка),

где ΔE — среднее значение изменений оптической плотности пробы при длине волны 340 нм за 1 мин;

V – конечный объем пробы в кювете (3,15 мл);

6,22 — коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при  длине волны 340 нм;

А – содержание белка в пробе, определенное в параллельном образце методом Лоури или другим, мг.

Описанный метод определения активности лактатдегидрогеназы высокоспецифичен, прост, дает хорошо воспроизводимые результаты и может быть использован при анализе активности фермента в различных тканевых препаратах и биологических жидкостях.

Оформление работы

Составить блок–схему эксперимента. Привести расчеты по приготовлению реактивов. Определить активность в предложенных пробах, привести расчеты.

Расчет соотношения НАД/НАДН

Соотношение НАД/НАДН в цитозоле рассчитывают на основе константы равновесия энзиматической реакции катализируемой лактатдегидрогенозой равной K = 1,11·10^–4 и концентраций ее субстратов: пирувата и лактата, применяя уравнение

[пируват]/[лактат] = K[НАД]/[НАДН] (Williamson и сотруд.,1967).

Опыт 8 .Определение активности каталазы

Каталаза – фермент, катализирующий реакцию расщепления пероксида водорода с образованием кислорода и воды. За ходом реакции можно следить по объему выделившегося кислорода.

Реактивы и материалы: растительный материал (листья или корни хрена, свежепророщенные семена или клубень картофеля); мел; 3 %-ный раствор пероксида водорода.

Оборудование: установка для сбора газа (рисунке 3); ступка с пестиком; стакан.

 

Рисунок 3- Газометрический прибор для определения активности каталазы. 1 – реакционная колба; 2 – зажим; 3 – бюретка с делениями; 4 – сосудик для раствора пероксида водорода; 5 – делительная воронка. Стеклянные части прибора соединены резиновой трубкой.

Ход работы

1. Растительный материал (0,5 г) разотрите в ступке с 20 см³дистиллированной воды с добавлением небольшого количества мела (для создания слабощелочной среды). Оптимальное значение рН для каталазы составляет 7,7.

2. Гомогенат ткани оставьте на 5–10 мин. для отстаивания и затем полученный раствор перенесите в реакционную колбу (1).

1. В небольшой сосудик (4) влейте 5 см³3 %-го раствора пероксида водорода и осторожно пинцетом поставьте его внутрь реакционной колбы (1).

2. При открытом зажиме (2) осторожно плотно закройте реакционную колбу (1) пробкой газометрического прибора.

3. Закройте зажимом (2) сообщение с атмосферой и одновременно переверните сосудик (4) с перекисью внутри реакционной колбы (1). Пероксид смешивается с гомогенатом, содержащим каталазу, что вызовет разложение пероксида и выделение кислорода.

4. Выделяющийся кислород, попадая сверху в бюретку (3), будет отжимать воду вниз. По понижению уровня воды в бюретке судят об объеме выделившегося кислорода. Для того чтобы выровнять давление выделяющегося кислорода с атмосферным давлением, необходимо выровнять уровни воды в бюретке и воронке (5), опуская воронку (5) вниз.

5. Определите объем выделившегося кислорода через разные промежутки времени от начала реакции (1, 2, 3, 4, 5 мин.).

6. Активность каталазы выражается в миллилитрах О₂, выделенного за время опыта, в расчете на 1 г сырой растительной ткани.

Оформление результатов

Результаты проведенного исследования оформите в виде таблицы.

Время, мин	Объем кислорода, мл	Масса навески растительного сырья, г	Активность каталазы, мл О2, на г сырого вещества за время опыта

Опыт 9. Обнаружение пероксидазы в соке клубня картофеля

Пероксидаза относится к группе ферментов оксидаз. По химической природе это гемопротеид, который с помощью перекиси водорода катализирует дегидрирование различных субстратов, например фенолов, которые при окислении превращаются в хиноны. Пероксидаза широко распространена в растительных тканях.

Материал и объекты исследования:клубни картофеля, пробирки, терка пластмассовая, марля, 1%-ный раствор гидрохинона, 3%-ный раствор перекиси водорода.

Ход работы: клубни картофеля измельчить на пластмассовой терке и из полученной массы через марлю отжать сок, который богат пероксидазой.

В три пробирки налить по 5 мл 1%-ного раствора гидрохинона, приготовленного на прокипяченной дистиллированной воде (перед началом опыта).

В первую пробирку добавить по 1 мл 3%-ного раствора перекиси водорода и картофельного сока, во вторую – внести только перекись водорода, а в третью – сок клубня картофеля.

Интенсивное побурение наблюдается только в первой пробирке, где происходит окисление гидрохинона в хинон за счет кислорода перекиси (при участии пероксидазы). Во второй пробирке окраска раствора почти не изменяется, но при длительном стоянии может появиться слабое побурение, так как гидрохинон окисляется кислородом, образующимся при спонтанном разложении перекиси водорода. Медленное побурение может наблюдаться и в третьей пробирке за счет окисления гидрохинона кислородом воздуха при участии полифенолоксидазы, также в небольшом количестве содержащейся в соке клубня картофеля.

Таблица - Схема записи опыта

Варианты	Состав смеси в пробирках			Окраска раствора в пробирках
	гидрохинон	Н2О2	сок клубня
1.	+	+	+
2.	+	+	-
3.	+	-	+

Задание:результаты наблюдений записать в таблицу 2, на их основании сделать вывод о характере действия фермента пероксидазы.