министерство образования и науки УКРАИНЫ

национальный технический университет

«харьковский политехнический институт»

Н.Ф. Клещев., н.В. Решетняк, н.М. Мартынюк Биоорганическая химия. Практикум

Учебное пособие

для студентов (в т.ч. иностранных)

биотехнологического направления

Утверждено

редакционно-издательским

советом университета,

протокол № от . . 2016 г.

Харьков

НТУ «ХПИ» 2016

ББК

К 7

УДК

Рецензенты:

Практикум содержит лабораторные работы по основам качественного и количественного анализа основных биомолекул, включая аминокислоты, белки, ферменты, нуклеотиды, углеводы, липиды, витамины. В пособии кратко изложены теоретические основы биохимического анализа биомолекул.

.

Призначено для студентів біотехнологічного напрямку підготовки.

Клещев Н.Ф.

К 78: Биоорганическая химия. Практикум / Н.Ф. Клещев, Н.В. Решетняк, Н.М. Мартынюк – Харьков: НТУ «ХПИ», 2016.– 228 с.– На рус. яз.

ISBN

С

ISBN © Н.Ф. Клещев, Н.В. Решетняк

Н.М. Мартынюк, 2016 г.

Содержание

Вступление……………………………………………………………………………………..…6

Общие правила техники безопасности в биотехнологической лаборатории……………...10

Правила техники безопасности при работе с кислотами и щелочами………………...........12

Правила техники безопасности с горючими жидкостями (ЛВЖ и ГЖ) …………...….....13

Правила техники безопасности с бытовым газом, спиртовкой и сухим горючим…….…14

Правила техники безопасности в лаборатории с химической посудой………...………..…15

Правила техники безопасности с электрооборудованием и электроприборами……….....16

Правила техники безопасности в лаборатории при работе с реактивами………...………..17

Правила техники безопасности в лаборатории при работе с биообъектами……………….18

Правила работы с оборудованием……………………………………………………………18

Вопросы для проверки полученных знаний ………………………………………………...21

1. Общая характеристика органических соединений………………………………………..22

1.1Основные понятия и классификация органических соединений………………………..22

1.2 Теории строения органических веществ. Изомеризация,виды изомеризации………...24

1.3 Химическая связь в органических соединениях………………………………………..36

Вопросы для проверки полученных знаний ………………………………..…………….…41

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ по разделу «Общая характеристика органических соединений»……………………………………………………………………………………………..41

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1. Определение классов органических соединений……….41

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2. Соотношение линейности свободной энергии в органических веществах………………………………………………………………………….……48

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3. Геометрическая изомерия и протонный резонанс в органических молекулах……………………………………………………………………………….52

2. ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ…………………….55

2.1 Кислотные и основные свойства органических соединений…………………………….55

2.2 Радикальные и электрофильные реакции углеводородов и их производные……….…66

2.3 Нуклеофильные реакции……………….………………………………………………....70

2.4 Окисление и восстановление органических веществ...………………………………….74

Вопросы для проверки полученных знаний …………………………………………………81

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ по разделу «Химические свойства органических соединений»…………………………………………………………………………………………….82

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4. Изучение кислотно-основных свойств органических соединений…………………………………………………………………………………………..….82

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5 Электрофильное замещение в ароматических соединениях…………………………………………………………………………………………….84

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6 Реакции нуклеофильного замещения и элиминирования у насыщенного атома углерода…………………….…………………………………………………….87

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7 Реакции нуклеофильного присоединения в альдегидахи кетонах…………………………………………………………………………………………………...88

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8 Реакции нуклеофильного замещения в карбоновых кислотах и их производных………………………………………………………………………….….91

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 9 Определение изоэлектрической точки желатины…………………………………………………………………………………..…………..…94

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 10. Окисление и восстановление в молекулах органических соединений……………………………………………………………………………………………….96

3. БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ…………………..…109

3.1 Поли- и гетерофункциональные соединения в процессах жизнедеятельности…..……109

3.2 Гетерофункциональные соединения в процессах жизенедеятельности…………..…....124

3.3. Реакционная способность и специфические свойства биологически важных гетерофункциональных соединений………………………….……………………………………….127

3.4 Важнейшие гетероциклические биоорганические соединения………………………...145

Вопросы для проверки полученных знаний ………….…………………………………….170

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ к разделу «БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ»…………………………………………………………………………………….…173

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №11. Поли - и гетерофункциональные органические соединения…………………………………………………………………………………………..….173

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 12. Биологически активные гетероциклические соединения……………………………………………………………………………………….……..175

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 13. Выделение фолиевой кислоты из дрожжей и ее обнаружение…………………………………………………………………………………………..178

4. БИОПОЛИМЕРЫ И ИХ СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ………………………….179

4.1 Углеводы. Поли-, олиго- и моносахариды……………………….……………………..179

4.2 Простые и сложные липиды…………………………..……………………………….…213

4.3 Протеины, пептиды и аминокислоты……………………………….…………………...230

4.4 Нуклеиновые и кислоты и нуклеотиды………………………………………………….255

Вопросы для проверки полученных знаний ……………………………………………….269

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ к разделу «БИОПОЛИМЕРЫ И ИХ СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ»……………………………………………………………………………………...271

ЛАБОРАТОРАЯ РАБОТА № 14. Моносахариды………………………………..……….271

ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ № 15 Дисахариды………………………………………….272

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 16. Полисахариды…………………….………………....273

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 17. Липиды…………………………………….……..…..277

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 18. Аминокислоты, пептиды……………………………286

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 19. Белки……………………………..…………………..291

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 20. Нуклеопротеины……………..……………………...305

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 21. Жирорастворимые витамины………………………312

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 22. Водорасторимые витамины………………..………316

5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ………………..………………………………………………………………………………323

5.1 Хроматографические методы анализа………………………………………...…………323

5.2 Спектральные методы анализа………………….………………..……………………….333

5.3 Электрохимические методы анализа……………………………………………….…....341

Вопросы для проверки полученных знаний ……………………...………………………....343

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ к разделу «ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ»……………………………………………………………….344

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 22. Применение тонкослойеной хроматографии в боорганике……..……………………………………………………………………………………...344

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №23.Применение распределительной хроматографии в биоорганике……………………….…………………………………………………………………..346

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 24 .Колоночная гель-фильтрация биоорганических молекул………………………………………………………………………………………………..354

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 25. Хроматоргафическое определение липидов…..…...356

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 26. Спектральное определение ферментов………….....360

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 27. Количественное опредеоление углеводов…..……..372

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 28 Спектрофотометрическое определение содержания β - липопротеинов плазмы крови………….………………………………………………………..374

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 29. Фотометрическое определение массовой доли протеинов в биологических объектов………………………………………………………….……375

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 30. Количественное определение ДНК……………..….378

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 31. Электрофоретическое разделение белков………...380

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 32.Определение аминного азота формольным титрованием по упрощенному методу Зеренсена-Гаврилова………………………………………………..…...386

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ТЕРМИНЫ…………………………………………………391

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………394

ВСТУПЛЕНИЕ

Биоорганическая химия изучает строение и биологические функции важнейших компонентов живой материи, в первую очередь биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов, уделяя главное внимание выяснению закономерностей взаимосвязи между структурой и биологическим действием. По существу она являетсяхимическим фундаментом современной биологии.

Разрабатывая основополагающие проблемы химии живого мира, биоорганическая химия способствует решению задач получения важных препаратов для медицины, сельского хозяйства, ряда отраслей промышленности.

Объекты изучения: белки и пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, биополимеры смешанного типа — гликопротеины, нуклеопротеины, липопротеины, гликолипиды и т. п.;алкалоиды, терпеноиды, витамины, антибиотики, гормоны, простагландины, ростовые вещества, феромоны, токсины, а также синтетические лекарственные препараты, пестициды и др.

Методы исследования: основной арсенал составляют методы органической химии, однако для решения структурно-функциональных задач привлекаются и разнообразные физические, физико-химические, математические и биологические методы.

Основные задачи:

• выделение в чистом виде изучаемых соединений с помощью кристаллизации, перегонки, различных видов хроматографии, электрофореза, ультрафильтрации, ультрацентрифугирования, противоточного распределения ит. п.;

• установление структуры, включая пространственное строение, на основе подходов органической и физико-органической химии с применением масс-спектрометрии, различных видов оптической спектроскопии (ИК, УФ, лазерной и др.), рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса, дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма, методов быстрой кинетики и т. п. в сочетании с расчетами параметров на ЭВМ;

• химический синтез и химическая модификация изучаемых соединений, включая полный синтез, синтез аналогов и производных,— с целью подтверждения структуры, выяснениясвязи строения и биологической функции,

• получения практически ценных препаратов; биологическое тестирование полученных соединений invitro и invivo.

Круг интересов биоорганической химии необычайно широк – это и мир веществ, выделяемых из живой природы и играющих важную роль в жизнедеятельности, и мир искусственно получаемых органических соединений, обладающих биологической активностью.

Биоорганичиская химия оказывает большое влияние на развитее всех дисциплин биологического и биотехнологического профиля и тесно связана с решением разнообразных вопросов практического значения. Без знания строения и свойств биополимеров и биорегуляторов невозможно понятие сущности биологических процессов.

Выяснение взаимосвязи структуры соединения с механизмом его биологического функционирования, т.е. взаимосвязи «структура-функция», является фундаментальной проблемой биоорганической химии. Эта проблема имеет общенаучное значение, особенно важна она для биологии и биотехнологии. Биоорганическая химия вместе с другими научными дисциплинами содействует развитию биологии и биотехнологии на молекулярном уровне и способствует их прогрессу.

Целью лабораторного практикума по биохимии является закрепление теоретических знаний путем формирования практических навыков в области статической, динамической и функциональной биохимии.

Лабораторный практикум содержит лабораторные работы разной степени сложности, позволяющие студентам овладевать методами биохимических исследований, умением анализировать полученные результаты.

В практикум включено подробное описание хода наиболее типичных работ по основным разделам классической биохимии: углеводам, липидам, нуклеиновым кислотам, белкам, ферментам, витаминам.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ 

Работать в лаборатории необходимо в халате, защищая одежду и кожу от попадания и разъедания реактивами и обсемененности микроорганизмами.

1. Каждый должен работать на закрепленном за ним рабочем месте. Переход на другое место без разрешения преподавателя не допускается.

2. Рабочее место следует поддерживать в чистоте, не загромождать его посудой и побочными вещами.

3. Студентам запрещается работать в лаборатории без присутствия преподавателя или лаборанта, а также в неустановленное время без разрешения преподавателя.

4. До выполнения каждой лабораторной работы можно приступить только после получения инструктажа по технике безопасности и разрешения преподавателя.

5. Приступая к работе, необходимо: осознать методику работы, правила ее безопасного выполнения; проверить соответствие взятых веществ тем веществам, которые указаны в методике работы.

6. Опыт необходимо проводить в точном соответствии с его описанием в методических указаниях, особенно придерживаться очередности добавления реактивов.

7. Для выполнения опыта пользоваться только чистой, сухой лабораторной посудой; для отмеривания каждого реактива нужно иметь мерную посуду (пипетки, бюретки, мензурку, мерный цилиндр или мерный стакан); не следует выливать избыток налитого в пробирку реактива обратно в емкость, чтобы не испортить реактив.

8. Если в ходе опыта требуется нагревание реакционной смеси, надо следовать предусмотренным методическим указаниям способа нагрева: на водяной бане, на электроплитке или на газовой горелке и др. Сильно летучие горючие вещества опасно нагревать на открытом огне.

9. Пролитые на пол и стол химические вещества обезвреживают и убирают под руководством лаборанта (преподавателя) в соответствии с правилами.

10. При работе в лаборатории следует соблюдать следующие требования: выполнять работу нужно аккуратно, добросовестно, внимательно, экономно, быть наблюдательным, рационально и правильно использовать время, отведенное для работы.

11. По окончании работы следует привести в порядок свое рабочее место: помыть посуду, протереть поверхность рабочего лабораторного стола, закрыть водопроводные краны, выключить электрические приборы.

Правила техники безопасности в лаборатории 

при работе с кислотами и щелочами

1. Кислоты и щелочи в большинстве относятся к веществам повышенного класса опасности и способны вызвать химические ожоги и отравления. Поэтому необходимо внимательно следить за тем, чтобы реактивы не попадали на лицо, руки и одежду.

2. Не ходить по лаборатории с концентрированными кислотами и щелочами, а наливать их только в отведенном для этого месте.

3. Разливать концентрированную азотную, серную и соляную кислоты следует только при включенной вентиляции в вытяжном шкафу.

4. Запрещается набирать кислоты и щелочи в пипетку ртом. Для этого следует применять резиновую грушу и прочее оборудование для отбора проб.

5. Для приготовления растворов серной, азотной и других кислот необходимо их приливать к воде тонкой струей при непрерывном перемешивании, а не наоборот. Приливать воду в кислоту запрещается!

6. Растворять твердые щелочи следует путем медленного добавления их небольшими кусочками к воде при непрерывном перемешивании. Кусочки щелочи нужно брать только щипцами.

7. При смешивании веществ, которое сопровождается выделением тепла, необходимо пользоваться термостойкой толстостенной стеклянной или фарфоровой посудой.

8. Разлитые кислоты или щелочи необходимо немедленно засыпать песком, нейтрализовать, и только после этого проводить уборку.

9. При попадании на кожу или одежду кислоты, надо смыть ее большим количеством воды, а затем 3-5% раствором питьевой соды или разбавленным раствором аммиака.

10. При попадании на кожу или одежду щелочи, после смывания ее большим количеством воды, нужно провести обработку 2-3% раствором борной, лимонной или уксусной кислотами.

11. Вещества, фильтры, бумагу, использованные при работе, следует выбрасывать в специальное ведро, концентрированные растворы кислот и щелочей также сливать в специальную посуду.

Правила техники безопасности при работе  с легко воспламеняющимися и горючими жидкостями (ЛВЖ и ГЖ)

1. Все работы с ЛВЖ и ГЖ должны осуществляться в вытяжном шкафу при включенной вентиляции, отключенных газовых и электронагревательных приборах.

2. Запрещается нагревать на водяных банях вещества, которые могут вступать между собой в реакцию, которая сопровождается взрывом или выделением паров и газов.

3. При случайном проливании ЛВЖ (сероуглерод, бензин, диэтиловый эфир и др.), а также при потерях горючих газов необходимо немедленно отключить все источники открытого огня, электронагревательные приборы.

4. Сосуды, в которых проводились работы с ЛВЖ и ГЖ, после окончания исследований должны быть немедленно освобождены от оставшейся жидкости и промыты.

5. Опыты с ядовитыми веществами и веществами, которые имеют сильно выраженный запах, можно проводить только в вытяжном шкафу.

6. При тушении бензина, спирта, эфира, пользоваться песком, которым следует засыпать на вспыхнувшее пламя.

7. При распознавании газа по запаху, который выделяется, нюхать газ только на определенном расстоянии, направляя его струю движением руки от сосуда к себе.

Правила техники безопасности при работе  

с бытовым газом, спиртовкой и сухим горючим

1. В связи с опасностью взрыва газовоздушной смеси, применение бытового газа для нагрева в лабораториях допускается в крайних случаях, когда отсутствуют электронагревательные приборы.

2. Перед зажиганием спиртовки нужно убедиться, что корпус ее не поврежден, фитиль выпущен на нужную высоту и развернут, а горловина и черенок фитиля сухие.

3. Зажженную спиртовку запрещается переносить с места на место; нельзя зажигать одну спиртовку от другой.

4. Тушить спиртовку нужно накрывая пламя колпачком. Задувать пламя запрещается.

5. В спиртовках используется только этиловый спирт; пользоваться бензином или другими горючими жидкостями запрещается.

6. Брикеты (таблетки) сухого горючего иногда могут использоваться для нагрева. Зажигать их следует на керамических пластинках, тушить – колпачками для спиртовок или керамическими тиглями. Брикеты, которые не догорели, после тушения надо убрать в вытяжной шкаф.

7. Нагревание реакционных смесей в пробирках и других стеклянных сосудах нужно проводить осторожно, предварительно насухо вытереть внешние стенки сосуда и, не допуская разбрызгивания смеси из сосуда. Горловина сосуда должна быть направлена в сторону, как от себя, так и от тех, кто работает рядом. Пробирку следует держать под наклоном. Нельзя наклоняться над жидкостью, которая нагревается, так как иногда ее может выбрасывать из сосуда. При нагревании пробирки над спиртовкой необходимо использовать специальный держатель для пробирок.

8. При возникновении пожара, прежде всего надо выключить все нагревательные приборы, затем тушить пламя. Его нельзя задувать. Если горят органические вещества, не следует заливать пламя водой. Используйте песок, пожарные одеяла, огнетушители (лучше углекислотные).

9. При незначительных ожогах (горячими предметами, веществами или паром) место ожога необходимо обработать спиртом или крепким раствором перманганата калия, а при более тяжелых ожогах следует немедленно обратиться к врачу.

Правила техники безопасности при работе

с химической посудой

1. Основным травмирующим фактором, который связан с использованием стеклянной посуды, аппаратов и приборов, являются острые осколки стекла, способные вызвать порезы тела работающего, а также ожоги рук при неосторожном обращении с нагретыми до высокой температуры частями стеклянной посуды.

2. Размешивать реакционную смесь в сосуде стеклянной палочкой или шпателем надо осторожно, не допуская разлома сосуда. Держать сосуд при этом необходимо за его горловину.

3. Перенося сосуды с горячей жидкостью, надо держать их двумя руками: одной – за дно, другой – за горловину, используя при этом полотенце (чтобы избежать ожогов кистей и пальцев рук).

4. При закрывании толстостенной посуды пробкой следует держать ее за верхнюю часть горловины. Нагретый сосуд нельзя закрывать притертой пробкой пока он не охладится.

5. В опытах с нагревом необходимо пользоваться посудой, которая имеет соответствующую маркировку.

6. В случае пореза стеклом нужно сначала внимательно осмотреть рану и извлечь из нее осколки стекла, если они есть, а затем обмыть раненное место 2% раствором перманганата калия, смазать йодом и завязать бинтом или заклеить лейкопластырем.

Правила техники безопасности при работе

с электрооборудованием и электроприборами

1. Химические лаборатории (включая биохимические и микробиологические) согласно степени опасности поражения электрическим током относятся к помещениям с повышенной или особой опасностью, которая обусловлена возможностью воздействия на электрооборудование химически активных сред.

2. Все работы, связанные с применением электроприборов должны проходить под наблюдением преподавателя (лаборанта).

3. При работе с водяной баней нельзя пробовать степень нагрева воды рукой.

4. При неисправности в работе электроприбора (например, подсветка в микроскопе) необходимо обратиться к преподавателю. Чинить самостоятельно приборы запрещается.

5. При поражении электрическим током, если пострадавший остается в соприкосновении с токоведущими частями, необходимо немедленно выключить ток с помощью пускателя или вывернуть пробку или перерубить токопроводящий провод изолированным инструментом. К пострадавшему, пока он находится под током, нельзя касаться незащищенными руками (без резиновых перчаток). Если пострадавший потерял сознание, после выключения тока нужно немедленно, не дожидаясь врача, делать искусственное дыхание.

Правила техники безопасности в лаборатории

при работе с реактивами

1. Если к работе не дано указаний относительно дозировки реактивов, то брать их для проведения опытов необходимо в возможно меньшем количестве (экономия материалов и времени, которое затрачивается на опыт).

2. Избыток реактива нельзя высыпать и выливать обратно в сосуд, из которого он был взят.

3. После расходования реактива банку или стакан необходимо сразу закрыть пробкой и поставить на место.

4. Сухие реактивы брать с помощью лопаток, пластмассовых или металлических шпателей. Шпатель должен быть всегда сухим и чистым. После расходования следует его тщательно обтереть.

5. Когда реактив отбирается пипеткой, ни в коем случае нельзя той же пипеткой, не вымыв ее, брать реактив с другой емкости.

6. При наливании реактивов нельзя наклоняться над сосудом, предотвращая попадания брызг на лицо или одежду.

7. Нельзя держать банку или стакан с реактивом, которую нужно открыть, держа в руках, ее надо поставить на лабораторный стол и только после этого открывать.

Правила техники безопасности в лаборатории

при работе с биообъектами

1. Необходимо четко выполнять инструкции к лабораторным занятиям.

2. В лаборатории запрещается принимать пищу, пить воду.

3. Работу с биологическим материалом проводить только инструментами.

4. При случайном попадании биологического материала (особенно микроорганизмов) на стол, руки, нужно провести обработку дезинфекционным раствором (например, хлорамином).

5. После работы необходимо тщательно вымыть руки с использованием дезинфекционных средств (детергентов).

Правила работы с оборудованием: