Выделение чистой культуры по способу Дригальского

При выделении чистой культуры аэробных микробов культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или желатину, разливают в стеклянные чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, т.к. влажная поверхность не способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят пипеткой одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем Дригальского втирают ее в поверхность питательной среды сначала на одной половине питательной среды, затем на второй, после чего этим же шпателем протирают поверхность плотной среды последовательно во второй, третьей и четвертой чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих - изолированные колонии.

Изолированные колонии аэротолерантных микроорганизмов и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного посева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помешают в кипящую водяную баню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений накопительной культуры в стерильном физиологическом растворе. Разведение готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0.5-1.0 мл разведения получить изолированные колонии. Степень разведения определяется плотностью накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки пламенем горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашки Петри. После того, как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии, выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают стерильными капиллярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает, сразу же гибели клеток, то посев проводят на поверхности среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат.

Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение накопительной культуры проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50°С агаризованной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведении. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (соотношение 3:1), что препятствует проникновению воздуха в толщу агаризованной среды.

Иногда агаризованную питательную среду после посева и тщательного перемешивания переносят в сушильные трубки Бурри - стеклянные трубки длиной 20-25 см, диаметром 1.0-1.5 см. Трубки предварительно стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают этот конец также резиновой пробкой.

Для этих целей можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующие разведения накопительной культуры в расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилляра запаивают.

При удачно выбранных разведениях накопительной культуры в одной из пробирок (трубок Пастера, пипеток Бурри) вырастают изолированные колонии. Чтобы извлечь образовавшиеся колонии, поступают следующим образом. Удаляют стерильной иглой слой парафина и вазелинового масла, а столбик агаризованной среды осторожно выдувают из пробирки в стеклянную чашку Петри, пропуская гав, не содержащий кислорода, через капилляр, который помещают между стенкой пробирки и агаризованной средой. Агаризованную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

Иногда плотную среду из пробирки извлекают иначе. Пробирку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным скальпелем и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают пинцетом и участки капилляра, содержащего изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Когда хотят получить изолированные колонии облигатных анаэробных бактерий, характеризующихся особенной высокой чувствительностью к кислороду (экстремальные анаэробы), используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Сущность этого метода заключается в следующем. Расплавленную агаризованную среду заражают при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя агаризованной среды позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

Выделение чистой культуры из одной клетки. Чистую культуру из одной клетки можно выделить капельным методом, с помощью микроманипулятора или микроселектора.

Капельный метод Линдера используют при работе с крупными микроорганизмами: дрожжами, мицелиальными грибами, водорослями. Порядок работы следующий. Накопительную культуру разводят в стерильной питательной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Затем на поверхность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером (микропипеткой) наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят препарат "висячая капля". Нанесенные на покровное стекло капли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых обнаружена только одна клетка. После этого препарат помещают в термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Через 12-24 часа отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в которых наблюдается образование микроколоний, осторожно снимают с покровного стекла кусочками стерильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой.

Выявление отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом (рис.5). Микроманипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлена влажная камера, в которую помещают препарат "висячая капля".

В держателях операционных штативов закреплены микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью с помощью системы винтов и рычагов. Микропипетки вводят во влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в "висячей капле", исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой.

Определение чистоты выделенной культуры.

Чистота выделенной культуры микроорганизмов должны быть тщательно проверена. Это осуществляется обычно несколькими способами -визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной плотной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред. Чистоту культуры микроорганизмов обязательно нужно контролировать под микроскопом. Для этого следует приготовить препарат фиксированных окрашенных клеток и просмотреть его с иммерсионной системой или препарат живых клеток и просмотреть его, используя фазово-контрастное устройство. Чистая культура микроорганизмов, как правило, морфологически однородна, допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Однако необходимо помнить, что клетки некоторых бактерий (например, микобактерий, нокардий и др.) очень полиморфны, поэтому определение чистоты таких культур при микроскопировании вызывает некоторые затруднения.

Чистоту культур микроорганизмов обязательно проверять высевом на питательные среды. Прежде всего, выделенную культуру высевают на плотную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний - свидетельство чистоты культуры, Обязателен посев на мясо-пептонный агар (МПА) - среду, которая обеспечивает рост многих хемогетеротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний или, напротив, отсутствие роста, если данные микроорганизмы на мясо-пептонном агаре не развиваются. Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур нельзя сделать только по результатам высева на MIA. Особенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также представителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганизмов проверяют высевом на ряд сред, состав которых определяется особенностями метаболизма выделенных микроорганизмов, а также их возможных спутников.

Рост и размножение микроорганизмов. Различают: 1/ рост микробов с равномерным помутнением среды; 2/ придонный рост; 3/ пристеночный рост; 4/ поверхностный рост. Характеризуя рост в жидкой среде, отмечают: степень помутнения - слабая, умеренная, сильная; особенности пленки при поверхностном росте - тонкая или толстая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая (морщинистая), бесцветная или окрашенная (указывают цвет), сухая или влажная; при образовании осадка указывают - скудный он или обильный, плотный или рыхлый, слизистый или хлопьевидный. Нередко рост микроорганизмов сопровождается пигментацией среды, выделением газа, появлением специфического запаха, что отмечается отдельно при характеристике роста.

Для культивирования микроорганизмов необходимо наличие жизнеспособной посевной культуры (инокулята), питательной среды, содержащей все необходимые элементы питания (источник энергии, углерода, макро- и микроэлементов и, в случае потребности, факторы роста), отсутствие в среде разного рода ингибиторов роста. Необходимо также поддержание оптимальных для роста микроорганизмов физико-химических условий окружающей среды (температура, рН, давление, условия аэрации, источники света и др.).

Автотрофы (автотрофия) – организмы, способные использовать углекислоту в качестве единственного или главного источника углерода и обладающие системой ферментов для ее ассимиляции, а также способные синтезировать все компоненты клетки. Некоторые А. могут нуждаться в экзогенных (поступающих извне) витаминах и факторах роста (ауксотрофы). В зависимости от источника энергии, используемого А. для восстановления СО2, различают фотоавтотрофы (наземные зеленые растения; водоросли; цианобактерии, способные к оксигенному фотосинтезу; фототрофные бактерии, осуществляющие аноксигенный фотосинтез) и хемоавтотрофы, получающие энергию за счет окисления неорганических соединений и осуществляющие хемосинтез. Большинство А. ассимилируют углекислоту через восстановительный пентозофосфатный путь (цикл Кальвина). А. – продуценты органического вещества в биосфере, образующие первый трофический уровень в сообществах.

Гетеротрофы – организмы, использующие для питания органические вещества; в узком смысле слова – организмы, использующие органические соединения в качестве источника углерода.

Фотогетеротрофы, фотоорганогетеротрофы – организмы, использующие в качестве источника энергии свет, а в качестве донора электронов и источника углерода – органические соединения. К Ф. относят пурпурные бактерии, гелиобактерии, зеленые нитчатые бактерии.

Хеми…, Хемо… – составная часть сложных слов, указывающая на отношение к химии или хим. процессам.

Лекция 2.3 Типы микробных культур. Кривая роста, особенности отдельных фаз и определение параметров роста. Периодическое и непрерывное культивирование, хемостат и турбидостат

СЛАЙД 1

Название темы лекции

……………………………………………………………………………………

СЛАЙД 2

Рассматриваемые вопросы:

1.Классификация способов и систем культивирования микроорганизмов.

2. Кривая роста, особенности отдельных фаз.

3.Определение параметров роста.

4.Периодическое и непрерывное культивирование (хемостат и турбидостат).

…………………………………………………………………………………………

СЛАЙД 3

Культивирование - это выращивание микроорганизмов на питательных средах в определённых условиях, а развивающийся при этом организм называют культурой.

Для осуществления любого процесса мик­робного синтеза необходимы культура микроорганизмов, питатель­ная среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогатель­ных операций, средства контроля и управления.

……………………………………………………………………………………….

Культивирование или выращивание микроорганизмов является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства микробных препаратов.

На стадии культивирования осуществляется накопление, как са­мой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.

Иногда (например, при производстве бактериальных препаратов) целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях - про­дукты, синтезируемые клеткой (антибиотики, ферменты, аминокис­лоты). При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

Необходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продуктов метаболизма) создаются, в основном, на этапе культиви­рования.

Основная задача на последующих этапах к примеру в технологии состоит в том, чтобы при выделении, сушке и других операциях максимально со­хранить и стабилизировать эти полезные свойства.

………………………………………………………………………………….

СЛАЙД 4