Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinacio — склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор­бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фа­зе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия). Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна. По данным признакам она уступает другим серологи­ческим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т. д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции.

При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо­вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти­тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным и, так как содержат антителя только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара

В инфекционной патологии и эпидемиологии РА наиболее применима в следующих направлениях:

а) для выявления АТ у больного, носителя, переболевшего и иммунизированного.  Исследуемую сыворотку титруют в изотоническом (физиологическом) растворе двукратно и последовательно (например, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д.) в пробирках лунках и добавляют корпускулярный антиген, чаще стандартные диагностикумы. 

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий.

 Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37  С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в определенном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туляремии -1:100. 

Для выявления антител можно ставить экспрессные реакции агглютинации (время учета несколько минут). Например: 

1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят каплю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляремийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков. 

2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютинации по Хеддельсону при бруцеллезе. 

Данные реакции не позволяют определить количество антител в сыворотке. 

б) для идентификации чистой культуры возбудителей инфекционных болезней. 

 С этой целью используются иммунные диагностические агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтами вакцин и сывороток, путем иммунизации животных целыми микробными клетками. 

 Для достоверности сыворотки лучше использовать адсорбированные, чтобы в них содержались только антитела, соответствующие определенному виду или типу микроорганизма. 

При идентификации (серотипирования) чистой культуры возбудителя часто ставят ориентировочную пластинчатую реакцию агглютинации. На стекла вносят капли диагностических агглютинирующих сывороток, в которые вносят изучаемую чистую культуру возбудителя. Результат учитывается через несколько минут. 

 Если сыворотки неадсорбированные – после ориентировочной ставят развернутую реакцию агглютинации. 

 Принадлежность микроорганизма к данному виду или типу устанавливают лишь в том случае, если он агглютинируется соответствующей диагностической сывороткой не менее чем до ½ или ¾ ее титра. 

Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы: первая — специфическое соединение антигена и антитела, вторая — кеспецифическая, т. е. образование видимого агглютината. Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.

Реакцию агглютинации широко применяют для серологической диагностики инфекционных заболеваний и определения антигенной структуры выделенных микробов. Для установления антигенной структуры возбудителя, выделенного из организма больного или носителя, используют специфическую иммунную сыворотку, полученную иммунизацией животных (кролика, осла, барана) определенными микроорганизмами. Идентификацию микроба проводят в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными или монорецепторными сыворотками или в пробирках с видовыми агглютинирующими сыворотками. Адсорбированные сыворотки содержат антитела только к специфическим для данного микроба антигенам, а монорецепторные — только к одному специфическому антигену возбудителя. Видовые сыворотки содержат антитела ко всем антигенам определенного микроба.

Рис. Пластинчатая реакция агглютинации

 

Принадлежность выделенной культуры микроорганизма к данному виду определяется при агглютинации его известной сывороткой до титра антител, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. Титром антител сыворотки считают последнее разведение ее, в котором еще наблюдается агглютинация культуры микробов, использованных для иммунизации животного. Адсорбированные и монорецепторные сыворотки используют обычно в реакции агглютинации на стекле неразведенными.

При.определении наличия антител в сыворотке крови больного ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия начиная с разведения 1 : 50 до 1 : 800 или более. В каждое разведение добавляют взвесь живых или убитых микробов. Препараты, содержащие микробы, убитые нагреванием или формалином, называют диагностикумами. Диагностикумы, полученные путем прогревания культур микроорганизмов, содержат только соматические антигены. При использовании только формалина у микробов сохраняются и жгутиковые антигены.

При наличии антител в крови больного происходит склеивание взятого в реакцию диагностикума и образование осадка (агглютината) на две пробирки. В этом случае результаты реакции агглютинации расценивают как положительные. В контрольной пробирке, куда вносят изотонический раствор хлорида натрия и диагностикум, взвесь микробов должна быть гомогенной (отрицательная реакция агглютинации).

Рис. Развернутая реакция агглютинация

 

Учет результатов реакции агглютинации при некоторых заболеваниях, например лептоспирозе, проводят только микроскопически в темном поле зрения микроскопа (микроагглютинация). Для постановки серологического диагноза заболевания учитывают диагностический заболевание. Обычно он соответствует разведению сыворотки 1 : 100 или 1 : 200.

Антитела в сыворотке крови больного с помощью реакции агглютинации можно выявить при заболевании брюшным тифом и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта), туляремии и др.

Реакция Кастеллани. При некоторых инфекционных заболеваниях или иммунизации микроорганизмами, имеющими в своем составе групповые антигены, в сыворотке крови, помимо специфических для данного вида антител, появляются еще и групповые. В этом случае родственные виды бактерий будут агглютинироваться полученными сыворотками.

Кастеллани предложил метод адсорбции групповых антител из иммунных сывороток, основанный на удалении их с помощью микроорганизмов родственных видов, которые имеют групповые антигены, но лишены специфических. Культура таких микроорганизмов, добавленная в сыворотку, адсорбирует неспецифические групповые антитела, и после удаления комплекса антиген — антитело с помощью центрифугирования в сыворотке остаются только специфические иммуноглобулины. Сыворотки, обработанные по методу Кастеллани, могут быть использованы в реакции агглютинации как высокоспецифичные.

 

Непрямые (пассивные) реакции агглютинаци Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О-группы человека). 

 Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации.  Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА). 

 Выпускаются коммерческие препараты – эритроцитарные диагностикумы (на эритроцитах нагружены известные молекулярные АГ), которые используются в РНГА для обнаружения специфических АТ в исследуемой сыворотке и эритроцитарные диагностикумы антительные (на эритроцитах нагружены Fc фрагментами известные АТ), которые применяются в РНГА для выявления АГ.

Рис. . Схема реакции пассивной гемагглютинации.

 Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции 

сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки». 

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти­фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами  разной групповой  специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

 

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) 

Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром  0,5-1,2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2-7 мин, что позволяет ее применять как экспресс-метод выявления антигенов и антител. Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.

Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т.д.

 

Рис. Проведение  реакции латекс-аглютинации

Учет реакции латекс агглютинации

 

Реакция коагглютинации (КОА) .Для постановки КОА  используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

 

 

Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. Смесь тщательно перемешивают  и через 2-5 мин. на тёмном фоне учитывают результаты.  На тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов: в реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества.

Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике. В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови. С помощью специфических преципитуючих сывороток против белка человека, разных животных и птиц можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. Таким же образом определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Эта реакция применяется для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). Реакцию Ухтерлони  используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

Реакция преципитации в жидкой среде

 Обязательным условием постановки реакции преципитации (РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании растворов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на другой. В этом случае по характеру образовавшего преципитата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Рис. Механизм  и положительный результат реакции кольцепреципитации

 

Рис. 15. Механизм реакций преципитации в агаре.

Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони.