Механизмы взаимодействия антигена с антителом

 

Взаимодействие антигена со специфическим антителом проявляется в организме образованием иммунных комплексов. Свойства комплекса АГ – АТ показано на рисунке 1. 

Прочному взаимодействию АГ с АТ способствуют: количество детерминант в АГ, количественное соотношение, последовательность расположения концевых групп аминокислот в детерминанте, наличие в детерминанте ароматических аминокислот, аффинность и авидность (рис. 2).

Аффинитет – это связь одного активного центра: Fab 1 или Fab 2 и детерминанты. 

Авидность – это cвязь всех активных цетров: Fab1 и Fab2 с детерминантами

Реакции АТ с АГ протекают также в системе «in vitro» и имеют ряд типичных характеристик: потребность в электролитах, обратимость, двухфазность (фаза взаимодействия активного центра АТ и детерминант АГ – несколько секунд или минут; фаза проявления – визуально наблюдаемый эффект - несколько минут или часов)

Часто такие реакции называют серологическими (от латинского «serum» – сыворотка), так как источником АТ служит сыворотка крови. 

Все серологические реакции можно разделить на несколько групп: 

1. Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в растворе электролита: реакция агглютинации в ее различных вариантах, реакция преципитации и ее различные модификации. 

2. Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция связывания комплемента, иммунного гемолиза и их модификации. 

3. Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: реакции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции торможения гемагглютинации. 

4. Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсонофагоцитарная реакция и другие. 

5. Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах. 

6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.

АНТИГЕНЫ

 

 Для серологических реакций могут быть использованы целые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоциты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, опухолевые клетки и т.д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА, РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (растворимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации, нейтрализации, ИФА и других. 

 Принципы получения корпускулярного антигена:

 Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивированные) клетки в изотонических или буферных растворах. 

 При инактивации клеток пользуются методами, не вызывающими изменения специфичности и снижения иммуногенных свойств. 

 Микроорганизмы инактивируют: 1) высокой температурой, подвергая медленному нагреванию во избежание денатурации белков; 2) химическими веществами (формалином, спиртом и другими); 3) ультразвуком, ультрафиолетом и рентгеновскими лучами. Облучением, в частности, инактивируют опухолевые клетки. 

 Стандартные антигены из инактивированных патогенных микроорганизмов широко применяются в серологическом анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и животных. 

 С помощью серологических реакций выявляют у исследуемых бактериальных клеток антигенный состав. 

 Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в серологических реакциях используют для определения локализованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови, СД-маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим антигенам. 

 

Принципы получения растворимых антигенов

 Для изучения природы, функции и иммуногенности отдельных антигенных веществ, входящих в состав клеток или других сложных систем, а также для выявления антител к от-дельным антигенам, необходимо получить антигены в чистом виде. Это многоступенчатый процесс, требующий применения комбинаций различных методов. 

 Антигены прокариот и эукариот получают экстрагированием различными растворителями целых или дезинтегрированных клеток.

 Так, из целых микробных клеток обычно экстрагируют вещества, которые нековалентно интегрированы в состав клеточной стенки. Например, белок А золотистого стафилококка и липополисахарид наружной мембраны Гр (-) бактерий. 

 Чаще экстракции предшествует дезинтеграция клеток. 

 Наиболее часто клетки разрушают: 1) механически в специальных приборах (дезинтеграторах и прессах); 2)клетки можно разрушить, воздействуя на них ультразвуком; 3) при помощи ферментов, которые разрывают ковалентные связи, разрушают отдельные клеточные структуры; 4) при помощи детергентов, которые связывают молекулы белков и липидов. 

 Полученную дезинтегрированную клеточную массу разделяют на отдельные клеточные компоненты, применяя различные виды центрифугирования: дифференциальное, зональное, равновесное в градиенте плотности. 

 Отдельные антигены из дезинтегрированных или интактных клеток, а также из их изолированных структур экстрагируют дистиллированной водой, буферами, растворами кислот, щелочей и т. д. 

 Экстракты – это сложные смеси антигенов и дополнительных балластных вещест

Антигены выделяют и очищают фракционированием различными методами: избирательным осаждением солями тяжелых металлов, гельфильтрацией, аффинной хроматографией с использованием моноклональных антител. 

 Высокая степень очистки микробных и тканевых антигенов имеет большое практическое значение, так как повышает чувствительность серологических реакций, следовательно, эффективность диагностики.

 

Принципы получения иммунных сывороток. 

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. 

 В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами. 

 В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, - их высокая специфичность и достаточное содержание антител. 

 По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические - к одному конкретному антигену. 

 Получить моноспецифические сыворотки можно: 1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены, 2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности. Для этого используют: 

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ - АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные антитела. 

 Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой) принадлежности и авидности, поскольку синтезируются разными клонами лимфоцитов, вовлеченными в иммунный ответ

 Идентичными по всем характеристикам являются антитела к одной антигенной детерминантной группе, продуцируемые клеточным клоном, происходящим из одного лимфоцита, т. е. моноклональные антитела. 

 Для иммунизации животных готовят корпускулярные или растворимые антигены различной степени очистки в зависимости от задач исследования. 

 Получение сыворотки, отвечающей предъявляемым требованиям, во многом зависит от кратности, сроков и способов введения антигенов. 

 Способы введения антигенов животным могут быть различными (внутривенные, подкожные, внутрикожные и другие). Хорошо комбинировать внутривенное и локальное введение антигенов. 

 Количество антител в полученной сыворотке устанавливают титрованием ее в соответствующей серологической реакции с гомологичным антиген

 

Все серологичные реакции используются с двоякой целью: 

1) для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни; 

2) для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками-антителами – для серологической идентификации возбудителей.