3.1. Последовательность аналитических процедур в метаболомике

Выделение метаболитов из тканей и клеток состоит из ряда стадий. Методики обработки тканей и клеток детально разработаны и широко применяются на практике в клинической диагностике.

Первоначально для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую (в жидкой или твердой среде) или немеханическую (ферментативную, химическую, физическую) обработку ткани (рис. 3.1).

Для ферментативной обработки (как правило, мышечной ткани, перед гомогенизированием) используют трипсин, коллагеназу, протеинкиназу-К и другие ферменты.

При механической обработке для мягкого растирания ткани ее предварительно измельчают ножницами, затем гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма).

В результате получают препарат со смесью метаболитов, содержавшихся в исходном образце.

Аликвоты полученного препарата используют для качественного и количественного анализа в целях определения метаболического профиля исследуемого органа. При этом идентифицируют различные метаболиты и определяют их количества. Проводят анализ полученных данных и ставят диагноз.

Современные методы качественного и количественного анализа - ГХ-МС, ЖХ-МС/МС, CE-МС, FT-МС-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия и др.

Рис. 3.1. Последовательность аналитических процедур в метаболомике

3.2. Методы анализа (обнаружения) и определения количества компонентов фракций

3.2.1. Хроматография

Хроматографию открыл и предложил как метод разделения и анализа смесей русский ученый Михаил Семенович Цвет в 1903 г.

Хроматография - аналитический метод, сочетающий в себе и разделение, и количественное определение веществ, входящих в состав многокомпонентных проб.

В основе разных методов хроматографии лежат адсорбционные процессы различной природы. Хроматография - один из немногих методов, сочетающий в себе и разделение, и количественное определение веществ, входящих в состав многокомпонентных проб.

Главным элементом для этих методов анализа являются хроматографические колонки.

Хроматографические колонки - трубки, стенки которых покрыты веществом неподвижной фазы.

В ходе анализа по трубке движется подвижная фаза (газ или жидкость) с исследуемой смесью (рис. 3.2).

В результате непрерывно повторяющихся процессов сорбции и десорбции веществ на стенке трубки происходит разделение компонентов исследуемой смеси.

Рис. 3.2. Принцип разделения в хроматографической колонке

Обязательным условием для проведения хроматографии является наличие двух фаз: неподвижной (стационарной) и подвижной. В результате того, что различные вещества (А, Д, Н) перемещаются вдоль неподвижной фазы с разной скоростью, происходит их разделение (см. рис. 3.2).

Различная скорость перемещения отдельных компонентов смеси вдоль неподвижной фазы связана со сложным характером взаимодействия в системе «вещество - подвижная фаза - неподвижная фаза». По механизму взаимодействия различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, хемосорбционную и молекулярно-ситовую хроматографию.

Колонки характеризуются эффективностью, селективностью и емкостью.

Эффективность является мерой расширения пика вещества при его движении вдоль колонки. При правильном подборе селективности неподвижной фазы удается разделить все индивидуальные компоненты даже самой сложной смеси.

Селективность определяется как разница в степени удерживания веществ разной природы на неподвижной фазе.

Емкость колонки связана с ее физическими размерами и определяет максимальный объем пробы, который можно ввести в колонку без ее перегрузки.