5. Тестирование биологической активности кс. Стандартизация и подбор тест-систем. Специфические и неспецифические модели (тест-объекты).

Практика показывает, что часто у применяемого вещества открываются новые, совсем неожиданные свойства (полезные и вредные). Поэтому в случае поиска веществ с конкретными видами биологической активности необходимо максимально полно определить у них весь спектр видов биологической активности.

Общие принципы

Необходимо эффективное мас­совое испытание КС на биологическую активность.

Скрининг - проверка большого массива КС на один или несколько видов БА.

Системное определение БА всего массива соединений может быть осуществление путем создания высокопроиз­водительной системы их классификации по видам БА. Каждый КС обладает определенными видами и степенью биологической активности.

Система тестирования КС по видам БА может включать два взаимосвязанных подхода:

1. уровень целевого объекта испытаний (человек, животное, растение, биогеоценоз), на который должно быть направлено действие искомого ксенобиотика, исходя из целей поиска (лекарства, ветеринарное сред­ство, гербицид и т. д.),

2. совокупность тест-объектов, базирующихся на использовании более примитивной организации жи­вой материи, чем целевой использование второго подхода оправдано в тех случаях, когда первый не обеспечивает достаточной производи­тельности и т. д.

Использование принципа качественного подобия - эпиморфизма тест-объекта и целевого объекта в отношении определенного биологического свойства ксенобиотика.

Принцип эпиморфизма - принцип конструктора: из небольшого числа деталей построить как можно большее количество фигур.

Главные методологические трудности при использовании эпиморфных моделей заключаются в том, чтобы определить оптимальный уровень детализации модели по отношению к моделирующему процес­су, т. е. целостному организму. Этого можно достичь исходя из того, что в системе тест-объектов на клеточном уровне организации пред­ставляются все царства живого и основные типы тканей организма че­ловека, а также из того, что у тест-объектов в совокупности определя­ются все основные реакции (гибель, повреждение, адаптация, прони­цаемость, метаболизм ксенобиотиков, синтез белка и ДНК, возбуди­мость и т. д.).

Говоря о БА КС, то для ее определения необходимы тест-объекты, на которых регистрируются определенные виды биологической реакции (гибель, измене- нис роста, изменение различных метаболических реакций и т. д.) при их действии; эти реакции часто называются тест-реакциями. В этой связи сле­дует рассмотреть принципы отбора и стандартизации тест-объектов при классификации КС по видам БА.

Совокупность набора тест-объектов клеточно-тканевого уровня должна удовлетворять главному принципу системы - представительно­сти выбранных биологических тест-объектов (БТО) по отношению к моделям биосферы и организму человека с соответствующим набором характеристик (тест-реакций), т, е. максимально удовлетворять постав­ленным задачам.

Предлагается подбирать тест-объекты по КРИТЕРИЯМ:

1. по молек-м рецепторам, являющимся мишенями для в-в с данными видами активности;

2. по принципу надмолек организа­ции и молекулярному составу (близость по структуре);

3. по функцио­нальному сходству;

4. по органному или тканевому происхождению;

5. по близости патологического состояния тест-объекта и реального объекта.

Первый критерий - самый сильный и надежный. На нём основан выбор ганглиев прудовика как модели нейро­нов головного мозга в отношении медиаторных и антимедиаторных ви­дов БА. Высокая гомология или даже тождество рецепторов для медиаторов у моллюсков и позвоночных служит основа­нием для надежности прогноза этих активностей на целевой тест-объект.

Второй (близость по структуре) и третий (близость по функции) кри­терии используются при выборе моделей для оценки влияния на под­вижность (сперматозоиды, тетрахимена), на дыхание и гликолиз (печень, эритроциты, клетки опухолей), на фотосинтез (водоросль Nitella), на хи­мический гомеостаз (печень - монооксигеназная система).

При всех трех критериях остается неопределенность прогноза, обу­словленная необходимостью переносить результаты ответов in vitro на систему in vivo, а именно тем, что in vitro не учитывается доступность объекта-мишени, метаболизма ксенобиотика и строения реального объекта. Гибель клетки - это не значит гибель организма. большая степень неопределенности существует для тех видов активно­сти, которым характерны системные эффекты на уровне ткани, органа или организма, т. е. в тех случаях важные, определяющие особенности действия химических соединений зависят не от взаимодействия с ка­кой-либо мишенью, а от взаимодействия с многими мишенями или всей реакцией системы на связывание с мишенью. Такие проблемы характерны для адаптогенов, витаминов, наркотиков.

В этом случае подбор биологических тест-объектов 4) по критерию ор­ганного происхождения дает значительную гарантию прогноза. Но надежнее строить прогноз по данным испытаний на всех объектах. И следует учитывать последний признак - бли­зость патологического состояния тест-объекта и реального объекта.

Классификация КС по видам БА по-новому ставит вопрос о подборе и стандартизации тест-объектов. Система должна обеспечить возможность сопоставления результатов испытаний на БА разных соединений, прове­денных в разные годы. Именно степень воспроизводимости, стандарт­ность набора тест-объектов непосредственно определяют надежность принимаемых решений и степень автоматизации системы (возможно, в большей степени, чем ЭВМ).

И если с молекулярными тест-объектами это сделать проще, то объекты клеточно-тканевого уровня организации - «живые». Как все живое, они непрерывно развиваются, подвергаются сильному влиянию эндогенных и экзогенных факторов, физиологическое состояние тест- объектов подвержено сезонным колебаниям и т. д.

Каждый тест-объект индивидуален, что приводит к целому ряду за­труднений при регистрации его характеристик, интерпретации данных, выявлении их соответствия поставленным целям и т. д.

Методич подходы для стандартизации, подбора, приготовления тест-объектов, напр:

- стандартизация условий содержания животных;

- использование контрольных карт (отбраковка животных, для которых отклонения согласно карте превышают определенную величину);

- выбор наиболее щадящих условий выделения и инкубации;

- использование дополнительных воздействий, переводящих тест-объект в заданное состояние; нор­мирование регистрируемых параметров (приведение к норме);

- вы­бор тест-реакций, минимальным образом зависящих от индивид-ти тест-объектов и т. д.

В конечном итоге для каждого тест-объекта клеточно-тканевой природы можно создать формализованный стандарт в виде набора ко­личественных параметров, характеризующих стационарные и кинети­ческие показатели тест-объектов.

Моделируемые объекты (клетки, организм, биосфера) предстают в сис­теме в виде представительных наборов тест-объектов, обладающих основ­ными элементарными функциями, присущими целевым объектам. В принципе, модели клетки и организма могут быть нормальными и патологическими.

Выборки тест-объектов и их расположение в системе должны отра­жать реальную иерархию элементов природного объекта, иерархию, обусловленную его развитием. Поэтому для организма детализацию видов БА следует строить по тканевой тропности действия, опираясь на чисто генетическую классификацию типов тканей, отражающую ход онтогенеза. Представление биосферы в сис­теме классификации должно основываться на таксономической клас­сификации организмов, отражающей процесс эволюции.

Вся совокупность операций по классификации КС выглядит:

• классификация химических соединений по видам БА на основании химических, физических и физико­химических свойств испытуемых чужеродных соединений при отсут­ствии биологического тест-объекта: расчетных операций над структу­рой соединения; экспериментального определения физико-химических свойств химических соединений;

• классификация по результатам взаимодействия чужеродных со­единений с моделями клетки, организма, биосферы, включающая по­следовательные иерархические уровни организации биологической материи.

различать СПЕЦИФИЧЕСКИЕ И НЕ­СПЕЦИФИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ ТЕСТ-ОБЪЕКТОВ. Первые - имеют четко выраженные молекулярные мишени-рецепторы (вспомним первый критерий), реагирующие на определенные химические соединения, т. е. на определенные виды биологической активности.

Однако неспецифическая модель является обязательным компонен­том для классификации КС. С одной стороны, оказывается возможным различать химические соединения, обладающие разными видами активности на полностью неспецифической для этих видов активности модели. Так, разработана аппаратура и методика для реги­страции 16 параметров реакции эритроцитов на воздействия химических соединений. При испытаниях таких разных по активности и химической природе веществ, как силитраны, тетрациклины, пенициллины, кортикостероиды.

В этом случае один и тот же тест-объект используется в качестве эпиморфной модели и как элемент классифицирующей системы, рабо­тающей в режиме логического конструктора.

основным вариантом является случай, когда предсказание биологической активности осуществляется через по­строение логической функции, элементами которой становятся реакции отдельных биодатчиков. Эти датчики являются одновременно ЭПИМОРФНЫМИ МОДЕЛЯМИ, позволяющими улавливать многие виды БА на основе как эпиморфных соответствий, так и логических функций, полученных при обратном скрининге. С другой стороны, использование неспецифической модели позволяет охаракте­ризовать дополнительный вид биологической активности химических соединений. Например, при многих заболеваниях значи­тельная часть неспецифических общепатологических симптомов свя­зана с появлением так называемых средних молекул (СМ) - вторичных эндогенных токсинов пептидной природы. Для вскрытия одного из путей патологического действия СМ была выбрана модель - клетка Nitella, на которой было показано прямое неспецифическое мембранотропное действие СМ, обусловленное их поверхностной активностью.

на этой модели можно предсказание широкий спектра БА с классификацией веществ по их механизму действия (например, на ионную проницаемость, ионные токи, функционирование отдельных транспортных систем и т. д.).

Вещества, представляющие по своим свойствам научный и практиче­ский интерес, проходят тестирование на безопасность. Объекты испыта­ний по-прежнему модельные, но оценке подлежат и такие виды опасного действия, как мутагенность, канцерогенность, эмбриотоксичность и др.

6. Реакции биотрансформации неорганических КС.

Реакции восстановления атомов с переменной валентностью. Трансформация арсенатов As⁵⁺ в арсениты As³⁺, селенатов Se⁶⁺ в селениты Se⁴⁺, хлоратов CI⁺⁶ в хлориты С1⁺⁴. При трансформациях это­го типа токсичность вещества нередко возрастает. атомов с переменной валентностью.

Реакции метилирования. Мо могут использовать реакции метилирования для превращения металлов в металлорганические соединения. Особое значение имеет способность некоторых мо превращать ионы ртути в метил- и диметилртуть:

Hg²⁺ + донор метильной группы —> СН₃ - Hg⁺,

СН₃ - Hg⁺ + донор метильной группы -> СН₃ - Hg⁺ - СН₃

Организмы, способные осуществлять эти реакции, в своих обыч­ных метаболических процессах используют трансметилирование, об­разуя такие соединения, как метан; в этих системах могут реагировать также и металлы.

В этой связи повышается опасность отравления живых организмов, В отличие от металлической ртути метилртуть почти полностью по­глощается организмом и лишь незначительная часть выводится из не­го. Метилртуть распределяется во всех тканях, тогда как неорганиче­ская ртуть накапливается главным образом в печени и почках. Кофак­тором, принимающим участие в переносе метальной группы к иону ртути, является метилкорриноид - вещество, содержащее витамин В₁₂.

Неорганическое соединение мышьяка трансформируется с образо­ванием тримсталированного производного.

Scopulariopsis brevicaulis CH₃ As₂0₃ ►CH₃-As-CH₃.

протекания процесса ме­тилирования попытка оценить способность других металлов участвовать в этой реакции Считают, что олово, палладий, золото, серебро и таллий могут метилироваться, тогда как сви­нец, кадмий и цинк не способны вступать в эту реакцию. вывод обусловлен тем, что алкины свинца, кадмия и цинка в водных раство­рах неустойчивы, и витамин B₁₂ не переносит металь­ные группы к этим элементам. способность металлов участвовать в метаболических процессах и превращаться в металл органические соединения должна учитываться в оценке их потенциальной значимости для окружающей среды.

Реакции конъюгации. Неорганический цианид обезвреживается в живых организмах конъюгацией с серой,-образу­ется тиоцианит:

SS0₃²" + CN -> SO3²" + SCN

Процесс катализирует роданаза. Фермент находится в митохондри­ях печени различных видов животных и растений. Донорами серы служат тиосульфаты, тиосульфонаты, полисульфиды.

Белки с низкой молекулярной массой и высоким содержанием цистеина (металлотионины) связывают ионы тяжелых металлов. Наиболее изу­чено связывание ими кадмия, хотя они могут связывать и др. металлы.

Путь биотрансформации сернистого газа (SO2). Изучен в растениях. Первая стадия - окисление в сульфиты (SO₃ ^2-) и сульфаты (SO ₄^2-) происходит в клеточной стенке при участии пероксидазы, затем происходит включение в фотосинтетический мета­болизм серы.

Аденозинфосфосульфат (AФS) - первый продукт в реакции взаимо­действия SO4 ^2- с АТФ. Активированный сульфат связыва­ется с серосодержащим переносчиком белковой природы и образу­ется комплекс C-SO₃, который восстанавливается до сульфида (CS-SH) при участии света через ферродоксин.При переносе на о-ацетилсерин (AS) образуется цистеин и метионин. В случае высокого содержания сульфаты аккумулируются в виде глутатиона.

Если восстан-щая сила превышает имеющиеся в наличии источники углерода, сера, соединяясь с водородом, образует дисуль­фид (H2S), который теряется в результате газового обмена.

Эффективность реакций детоксикации ограничена. При продолжительном поглощении SO2 и увеличении кислотности буферная способность цитоплазмы становится недостаточной, уровень сульфитов в хлоропластах увеличивается, и S0₂ занимает места связывания С0₂ на рибулозодифосфаткарбоксилазе. В результате этого происходит ингибирование вторичных процессов фотосинтеза и раз­рушение третичной структуры ферментов.

7. Общие представления о стадиях биотрансформации КС. Ферментные системы, основные закономерности действия ферментов. Индукция защитных свойств организма.

Все биохимические реакции в живых системах носят ферментативный характер. А это значит, что клетка обходится без высоких t и давлений именно благода­ря деятельности ферментов-катализаторов, способных ускорять реак­ции в миллионы раз в самых обычных условиях.

Все ферменты имеют белковую макромолекулярную природу и упро­щенно могут быть представлены в виде сферических или палочковидных образований, на поверхности которых располагаются активные и регуля­торные центры. Как сам фермент, так и его центры состоят из упорядо­ченно расположенных, создающих определенный пространственный узор полимерных нитей, построенных из аминокислот. Эти ам-ты по­следовательно сшиты между собой ковалентными (пептидными) связями.

Для каждого фермента характерен свой геометриче­ский узор активного и регуляторного центров, что определяет его высо­кую специфичность к превращаемым веществам-субстратам.

Реакция начинается после того, как образуется фермент-субстратный комплекс, т. е. как только ключ субстрата войдет в замочную скважину активного (сорбционного) центра фермента, для чего необходимо строгое геометри­ческое соответствие их форм (пространственных и зарядовых геометрий). Специфичность такого взаимодействия столь велика, что стереоизомеры одного и того же вещества, например d- и I-ам-ты с одинаковыми структурными формулами, подвластны действию своих специальных ферментов: оксидаза d-аминокислот не окисляет l-изомер и наоборот. Вы­сокая специфичность ферментов - одно из главных условий для наведе­ния должного порядка в химических превращениях.

Как же ферменту удается резко ускорить течение реакции? Для процесса взаимодействия двух веществ А и В с образованием про­дукта С необходимо, чтобы к моменту столкновения А и В они обла­дали таким запасом энергии, которого было бы достаточно для крити­ческой деформации электронных облаков молекулы, т. е. для разрыва и новообразования прочных химических связей, превращающих суб­страты А и В в новый продукт С. Этот энергетический барьер - энергия активации - главный ограничитель скорости хими­ческого процесса. Действие фермента сводится к снижению высоты барьера. С этой целью фермент вступает в прямой контакт (комплекс) с молекулами субстрата, снижая энергетический барьер несколькими способами. Во-первых, на упругом полимерном каркасе фермента мо­жет растянуться и ослабиться «неугодная» химическая связь между атомами субстрата. Во-вторых, субстрат на ферменте может приобре­сти способность принимать множество конфигураций, из которых хотя бы одна облегчит переход к новому веществу. В-третьих, не исключе­на возможность сближения и принятия нужной ориентации реаги­рующих молекул субстрата. Все эти события разыгрываются на актив­ных центрах, хотя и остальная часть белковой глобулы служит резер­вуаром энергии для борьбы с энергетическим барьером.

Ферменты способны неутомимо и без износа повторять реакцию миллиарды раз, перерабатывая все новые и новые молекулы субстрата.

Есть еще и регуляторные центры. В них не происходят каталитиче­ские превращения. В зависимости от избытка или недостатка продук­тов ферментативной реакции эти центры замедляют или ускоряют ход процесса. В самом простом случае при избытке продукт присоединя­ется к центрам и предотвращает наработку новых. Когда продукта ма­ло, регуляторные центры освобождаются и перестают тормозить рабо­ту активных центров.

Для обозначения фермента к названию катализируемой реакции прибавляется суффикс «аза». Например, дегидрогеназа - это фермент, катализирующий удаление из молекулы атомов водорода; метил- трансфераза - трансформирует метальную группу и т. д.

Особую группу КС представляют самораспадающиеся соединения (основное место здесь занимают лекарственные препара­ты), спонтанно разрушающиеся в организме с образованием продук­тов, не обладающих биологической активностью в данных концентра­циях. Распад таких соединений не зависит от наличия ферментов, что важно в случаях, когда наблюдаются нарушения функций отдельных органов (печени или почек), т. е. в случаях, когда в организме отмеча­ется нехватка ферментов метаболизма.