27.Химиобиологические закономерности кс и подходы, используемые для их установления.

Связь между структурой и биологической активностью ксенобиотиков

связи между химической структурой соединения и его физико-химическими свойствами, с одной стороны, и характеристиками биологической активности, с другой стороны, позволяет прогнозировать и предсказывать последствия при его попадании в организм, в биосферу и способствует целенаправленному синтезу веществ с заданными свойствами.

Структура означает строение вещества, определяющее все его физические и химические свойства (вытекающие из химической формулы и определяемые экспериментально). Активность - это взаимодействие вещества с центрами-мишенями, которое может быть связано длинной цепью событий с наблюдаемым физиологическим эффектом. влиянии строения вещества на биологическую активность рассматривается, когда действие его на конкретную мишень (место связывания).

Для анализа связи между структурой вещества и их биологической активностью используются различные физические и химические характеристики вещества:

параметры веществ, изучаемых при установлении соотношения структура-активность, рассматривают молекулярная масса, плотность, молекулярный объем, критическое давление, теплоемкость, поверхностное натяжение, вязкость и т. д.

биологическая активность ксенобиотиков способна распределяться между липидной и водной фазами. такая корреляция наблюдается с теми физическими и химическими показателями, которые по природе своей связаны с коэффициентом распределения.

Для оценки биологической активности ксенобиотика по его физико-химическим свойствам применяются методы, основанные на поиске корреляционных связей между этими показателями и биологической активностью. могут быть получены соотношения, передающие зависимости между структурой и активностью вещества. на примере сопоставления скоростей разрушения (CP) ряда третичных аминов с величинами рК, и коэффициентом распределения (Кр). Для измерения скорости N-диметилирования использовали микросомные препараты печени крысы*

[О]

R,R₂NCH₃ -> R,R₂NH +CH₂0.

Изучались скорости разрушения 18 соединений. С помощью множественного регрессионного анализа было выведено соотношение зависимости логарифма CP от логарифма коэффициента распределения (величина рК_а для упрощения расчетов принималась равной 9,5):

lg CP = a lgK_p - в lgK_a – с (1)

(показатели а, в, с имеют численные значения).

Положительные значения множителя перед lgK_p указывает, что с увеличением коэффициента распределения CP повышается. Соединения с более высокими значениями К_р в микросомной мембране легко достигают ферментативной системы, осуществляющей реакцию диметилирования.

отрицательное значение множителя перед рКа указывает на то, что при увеличении рК_а скорость деметилирования снижается. Это способность вещества распределяться в мембране, а также механизмом реакции диметилирования. При рН меньше рКд соединения существуют в основном в положительно заряженной форме. Поэтому при рКа выше рН физиологических растворов (рН 6-8) доля амина, находящегося в нейтральной форме, снижается. незаряженная форма распределяется в мембране более легко, повышение рК_а может привести к снижению скорости реакции вследствие уменьшения потока вещества к активным местам.

реакция диметилирования проходит в близости от атома азота, она, зависит от электронной плотности на этом атоме. Более высокие значения рК_а отвечают повышению электронной плотности на атоме азота, так как протон сопряженного основания диссоциирует менее легко. При повышение электронной плотности на атоме азота может влиять на скорость реакции.

Введение в соотношение (1) дополнительного члена - (-рК_а)², учитывающего влияние электронной плотности, обеспечивает высокую точность расчета (позволяет объяснять свыше 90 % наблюдаемых изменений скоростей реакции).

Многие соединения испытывались на предмет обнаружения у них того или иного рода биологической активности.

эффективные яды - это соединения, являющиеся аналогами природных биорегуляторов. Например, распространенный гербицид 2,4-Д (дихлорфеноксиуксусная кислота)

близок в структурном отношении по расположению карбоксильной группы относительно ароматического кольца гормону - индолилуксусной кислоте (ИУК),

регулирующему ростовые процессы у растений. Попадая на листья, 2,4-Д легко поглощается, вызывая регуляторные расстройства, приводящие, если концентрация его достаточно высока, к гибели растения. Поскольку злаковые (однодольные) оказались устойчивее к действию 2,4-Д, чем двудольные, его и стали применять для борьбы с сорняками.

В приведенной паре соединений структурное сходство достаточно очевидно: оба они - производные уксусной кислоты, содержащие ароматический заместитель.

Способность соединения имитировать какой-то «естественный» метаболит обусловлена выраженной близостью молекулярного строения.

При оценке «близости» структуры и свойств нового соединения с каждым из исследованных соединений необходимо:

• определить точно характер действия (наличие или отсутствие которого должно быть предсказано);

• располагать сведениями о проявлении соответствующего характера действия соединений известной структуры.

Есть много способов меры близости с учетом валентного строения, наличия электрических зарядов на атомах, объема заместителей и т. п. Но испытание биологического действия нового соединения обнаруживает активность, сходную с активностью тех из ранее исследованных веществ, которые близки ему по принятым условным оценкам.

предсказание потенциальной биологической активности химических соединений с известной структурой и физико-химическими свойствами - проблема сложная. простой случай - это когда соединений с близкой структурой. Физические, химические и физико-химические свойства таких соединений будут близки. Если характеристики выбраны удачно, а биологическая активность для данного ряда соединений известна, то такие соединения могут образовывать стандартный ряд (обучающую выборку). За основу классификации взяты спектральные характеристики флуоресценции: нормированные значения максимума (П) и полуширины (X) в спектре флуоресценции, получаемые путем специальной обработки.

Биологическая активность в этом случае может быть представлена по попаданию нового тестируемого соединения в один их кластеров, объединяющих соединения со сходными видами активности. при таком подходе ошибки предсказания активности очень велика. Например, отсутствие у стероидов метальной группы у С_]8, лишающее их активности, практически не скажется на спектрах поглощения в ближней УФ-области.

При исследовании закономерностей изменения биологической активности в ряду аналогов некоторого вещества обычно модификации, вызывающие сдвиг биологической активности, разделяют на две группы: модификации, связанные с изменением сродства молекулы к мембра-нактивным структурам (рецептору), и модификации, нарушающие развитие реакции системы на образование комплекса вещество-рецептор. Сродство молекулы любого вещества к рецептору (активному центру) связано с определенными элементами ее пространственной структуры, обеспечивающими взаимную комплементарность рецептора и агониста.

С другой стороны, внутренняя активность определяется природой функциональных групп (присутствием ароматического радикала, кислотной группы, гидрофобной группы и т. п.).

корреляции между параметрами, характеризующими пространственную структуру молекулы, и ее биологической активностью, в качестве меры биологической активности используют ряд показателей, например lg LD₅₀, нельзя исключить аналогичной связи и в отношении показателя внутренней активности.

молекулы многих веществ имеют в растворе стабильную конформацию, для осуществления взаимодействия с активным центром нужно одна или немногие из них.

Поэтому наряду с определением спектра стабильных конформаций молекулы ксенобиотика возникает необходимость выявления так называемой «биологически активной» конформаций.

Под конформацией молекул следует понимать различные пространственные формы молекулы, возникающие при изменении относительной ориентации отдельных ее частей в результате внутреннего вращения атомов или групп атомов вокруг простых связей, изгиба связи и т. д.

В основе расчетов лежит нахождение таких структур, которым соответствуют минимумы суммарной энергии внутримолекулярного взаимодействия всех пар атомов.

Накопленные к настоящему времени результаты позволяют утверждать, что на основании этих подходов возможно дать качественное объяснение многим закономерностям проявления биологической активности веществ, но и прогнозировать последнюю.

особенности показателей связи между структурой веществ и их биологической активностью:

• гидрофобность (липофильность), определяемая соотношением в структуре молекулы гидрофобных и гидрофильных групп. Для организмов имеет значение сочетание двух свойств: гидрофобности и стабильности молекул в воде.

• Ионизация (или другой показатель распределения электронов).

• значение имеет содержание галогенов в молекуле ксенобиотика. Замена атомов водорода в молекуле вещества на атомы галогенов увеличивает устойчивость данного соединения.

• на биологическую активность влияет конформация молекул.

• Замена двойной связи в молекуле на эпоксигруппу приводит к увеличению биологической активности вещества и повышает его персистентность.

Или???

Тест-объект (test organism) - организм, используемый при оценке токсичности химических веществ, природных и сточных вод, почв, донных отложений, кормов и др. 

Тест-объекты, по определению Л.П.Брагинского - "датчики" сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оперативно констатировать факт токсичности (ядовитости, вредности) водной среды ("да" или "нет"), независимо от того, обусловлена ли она наличием одного точно определяемого аналитически вещества или целого комплекса аналитически не определяемых веществ, какой обычно представляют собой сточные воды.Тест-объекты с известной степенью приближения дают количественную оценку уровня токсичности загрязнения водной среды - сточных, сбросных, циркуляционных и природных вод. 

Для биотестирования используются различные гидробионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы. популярные объекты - ювенальные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis. Cемидневный тест на суточной молоди цериодафнии Ceriodaphnia affinis позволяет за более короткий срок (7 сут), чем на Daphnia magna (21 сут) дать заключение о хронической токсичности воды. 

Важное условие правильного проведения биотестирования - использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность в токсическим веществам. 

Стандартные методики, регламентированные нормативными документами, определяют тест-объекты, которые используются при определении токсичности тех или иных сред. В Украине в качестве стандартных приняты тесты с ветвистоусыми и жаброногими ракообразными, водорослями, инфузориями, светящимися бактериями.

Тест-организмы – это высокочувствительные организмы, широко представленные в определенных географических зонах, доступные для сбора, удобные для содержания и культивирования в лаборатории и хорошо изученные. 

Например, для биотестирования водных объектов используют различных гидробионтов – водорослей, микроорганизмов, беспозвоночных, рыб. Наиболее популярные объекты – ювенильные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis. Важное условие правильного проведения биотестирования – использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность к токсическим веществам. 

В биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды используют критерий токсичности (toxicity criterion) – тест-функцию. Тест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестирования для различных объектов:  – для инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых – выживаемость (смертность) тест-организмов;  – для ракообразных, рыб, моллюсков – плодовитость, появление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дробления яйцеклеток;  – для культур одноклеточных водорослей и инфузорий – гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры;  – для растений – энергия прорастания семян, длина первичного корня и др. 

Начальное, оценочное тестирование токсичности различных химикатов – это, как правило, острые опыты с высокими концентрациями добавок продолжительностью до 5 суток. Такие опыты необходимы, так как они демонстрируют возможную вредность меньших доз вещества при более длительном воздействии. Следовательно, при определении подпороговой концентрации вещества главное внимание в острых токсикологических опытах должно быть уделено поиску наиболее чувствительных организмов. 

Основным методом оценки чувствительности тест-организмов к токсикантам является регистрация их смертности. Основная (классическая) продолжительность теста – 96 часов. Как отмечают А.Н. Тюрин и Н.К. Христофорова (Биология моря, 1995), причина «классической» длительности токсикологических тестов в 96 часов, скорее, социальная, чем фундаментальная, и имеет корни в исторически сложившейся продолжительности рабочей недели ученых разных стран – 5 суток. 

В начале XX века основным методом оценки токсичности среды был метод определения выживания рыб – так называемый метод «рыбной пробы». Основоположники метода – российские ученые Гримм, Арнольд, Чермак, Долгов, Никитинский. Метод получил широкое распространение и за рубежом; благодаря простоте и удобству его применяют до сих пор. Недостаток метода заключается в необходимости длительного периода адаптации рыб к лабораторному содержанию (15–20 сут.), которое само по себе является стрессом. Дальнейшее развитие метод «рыбной пробы» получил в США после разработки систем для бесконтактной регистрации двигательной активности и некоторых поведенческих реакций рыб, по изменению которых определяли наличие токсикантов в среде