Глава 3 результаты исследования и их обсуждение

3.1 Получение белка scFv4d5

П лазмида pET23d::scFv4D5 была создана в лаборатории молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва) под руководством член-корр. РАН, д.б.н. С.М. Деева. Был получен рекомбинантный штамм-продуцент фрагмента двудоменного антитела (scFv) путем трансформирования клеток E. coli BL21(DE3) плазмидой, переданной нам в рамках совместных работ. По достижению культурой оптической плотности 0.6-0.8 О.Е. проводили индукцию экспрессии ИПТГ (1 мМ) в течение 4 ч при 30 °С. Экспрессия scFv4D5 в клетках Escherichia coli BL21(DE3) проявлялась в составе бактериальных телец включения в нерастворимом виде. Результат экспрессии белка был представлен в виде ДСН-электрофореза лизатов клеток в 12.5 %-ом полиакриламидном геле (рисунок 3.1), а также в восстанавливающих (+β-MЕ) и невосстанавливающих условиях (+β-MЕ).

1 2 3

Рисунок 3.1 - Экспрессия белка scFv4D5

1. - Клетки E. coli BL 21 (DE-3); 2. - Клетки E. coli BL 21 (DE-3) после 4 часов индукции ИПТГ; 3. - Маркер молекулярного веса (18, 22, 30, 41, 53 к Да)

На электрофореграмме отчётливо виден фрагмент антитела scFv4D5 (молекулярная масса приблизительно 29 кД). Растворимая фракция клеточного лизата, включающая цитоплазму и периплазму, практически не содержала целевого белка.

Восстановление дисульфидных связей увеличило скорость продвижения белка в геле, что согласуется с тем, что при электрофорезе белков (по Лэммли) в невосстанавливающих условиях наблюдается снижение скорости продвижения белка, а в восстанавливающих условиях, при которых в результате разрушения межмолекулярных дисульфидных связей цепи иммуноглобулинов разделяются и движутся согласно их массе.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 3.2 - Очистка белка scFv4D5

1.- Осадок телец включения; 2. - Супернатант после растворения телец включения 3, 4 - Промывка буфером 5. - Неспецифическое снятие в 20mM имидазола 6. - Элюция белка в 200 mM имидазола.

На различных стадиях очистки двухдоменного белка scFv4D5 отбирали пробы после последовательных отмывок и элюции на колонке для анализа чистоты методом электрофореза (рисунок 3.2). В результате в 200 mM имидазола двудоменный белок scFv4D5 был элюирован с высокой степенью чистоты.

3.2 Получение наноантитела 2d3.

Синтез нуклеотидной последовательности был произведен в GenScript (США) и предоставлен нам встроенным в вектор pUC57 (3124 bp). Полученной конструкцией был трансформирован штамм бактерий E. Coli JM107 для увеличения количества вставки целевого гена. Результат рестрикции ферментами NotI и NdeI оценивали визуально, после гель-электрофореза плазмидной ДНК в системе 1,5%- го геля агарозы и буфера TBE. Полученные электрофоретическим разделением ДНК в геле агарозы (1.5 %) рестрикционный фрагмент 2D3 и вектор pET-22b были выделены и очищены с помощью спин-колонок компании “Promega” согласно протоколу производителя. Для дальнейшей экспрессии рекомбинантного однодоменного антитела ген, кодирующий целевой пептид, был переклонирован в полилинкер экспрессионного вектора pET-22b(+) (“Novagen”, Германия), в котором ген целевого белка находится под контролем Т7 промотора, по сайтам рестрикции NotI и NdeI. Данная генная конструкция позволила при трансляции получить полипептид однодоменного антитела по аминокислотной последовательности соответствующего 14.43 кДа с метионином на N-конце и 6-His тэгом на С-конце, что позволило использовать металл-хелатную аффинную хроматографию (Ni-NTA) при очистке белка. Полученной плазмидой со вставкой был трансформирован штамм Е. coli BL21(DE3). Для оценки работоспособности экспрессирующей системы позитивные колонии выращивались до достижения логарифмической фазы роста. Индукция транскрипции искомого полипротеина стимулировалась добавлением в среду индуктора изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до 1 мМ. Клетки инкубировались в течение 4 часов. Результаты предоставлены в виде 12.5% ДСН-ПААГ электрофореза индуцированных и неиндуцированных клеток. Окрашивание проводили раствором Кумасси голубым R 250.

1 2 3

10000

3000

1000

500

Рисунок 3.3 - Рестркция pET22b::2D3

1.- Плазмида pET22b::2D3; 2. - Рестрикция плазмиды pET22b::2D3 по сайтам рестрикции NotI и NdeI; 3. - Маркер молекулярного веса: #sm0331 Fermentas

В результате очистки на хроматографической колонке Mono-Q раствор белка однодоменного наноантитела 2D3 (pI = 6.9) частично избавился от примесных белков. Результаты представлены в виде электрофореграммы (рисунок 3.4).

1 2 3

Рисунок 3.4 - Электрофореграмма очистки рекомбинантного полипротеина 2D3 в ДСН-ПААГ.

1. – 2D3 тельца включения; 2. – 2D3 хроматографически очищенный; 3. – MMW Roti-M (14 кДа, 20 кДа, 29 кДа, 43 кДа, 66 кДа, 118 кДа, 212 кДа)