1.1.3 Наноантитела

Нуклеотидную последовательность гена наноантитела можно эффективно клонировать и экспрессировать в бактериях и дрожжах. Получаемое в виде мономера однодоменное наноантитело (с размерами~2.5 нм в диаметре и ~4 нм в высоту и молекулярной массой 12–15 кДа) – наименьший из известных на сегодня белков, обладающих свойством специфически связывать антиген.[2] Антиген-узнающий участок HCAb формируется лишь одним вариабельным доменом (VHH), который непосредственно связан через шарнирный район с Fc-доменом. Это делает возможным использование только одного домена, который реализует в полном объеме функцию антигенсвязывающего агента[9]. Один из наиболее популярных подходов к получению рекомбинантных антиген-узнающих фрагментов антител – модифицированный метод фагового дисплея, основанный на отборе из больших библиотек клонированных в фагмидном векторе ДНК-последовательностей (кодирующих рекомбинантные белки, экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов) клонов, кодирующих белки (антитела), способные специфически связывать определенный лиганд (антиген) [27]. Одна из проблем традиционных рекомбинантных технологий – необходимость работы с очень большими по числу клонов библиотеками ДНК рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены все возможные комбинации последовательностей двух случайных вариабельных доменов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов). Помимо этой проблемы, здесь также возникают и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, и проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к агрегации. Упомянутые проблемы в значительной мере преодолеваются при использовании технологии фагового дисплея для клонирования генов однодоменных антиген-узнающих VHH-доменов (наноантител) неканонических антител HCAb [27]. Практически каждый клон в получаемой библиотеке будет кодировать функциональный VHH-домен, который обладает определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного. В этом случае достаточно использовать относительно небольшие исходные библиотеки (из 10⁶ клонов) для эффективного отбора клонов нужных наноантител. Получаемое “на выходе” наноантитело, в отличие от вариабельных доменов классических антител, как правило, хорошо растворимо, устойчиво к значительным колебаниям температуры и pH, а также может быть экономично наработано в больших количествах в бактериях или дрожжах.

Наиболее эффективная процедура получения наноантител включает следующие три этапа. Во-первых, это индукция образования антител (HCAb) при иммунизации животного (из семейства верблюдовых). Обычно проводят пять повторяющихся подкожных инъекций антигена, смешанного с адъювантом Фрейнда, в течение 2–2.5 мес. (процедура подобна той, что используется при иммунизации кролика или козы). Во-вторых, осуществляют клонирование всего разнообразия генов наноантител из В-лимфоцитов периферической крови иммунизированного животного. Обычно для этого достаточно 100 мл крови. Проводят ряд последовательных биохимических и молекулярно-биологических процедур – выделения из фракции белых клеток крови полиаденилированных РНК, синтеза кДНК, двухстадийной ПЦР со специфическими праймерами, рестрикции и очистки библиотеки последовательностей генов наноантител, встраивания этих последовательностей в фагмидный вектор. Наконец, проводится базирующаяся на методе фагового дисплея процедура селекции наноантител с заданной специфичностью. Значительное число исследований посвящено получению наноантител для диагностики и лечения раковых заболеваний, в том числе получение антител специфичных к c-ErbB2 [37;8]. Антигенсвязывающие центры верблюжьих антител сформированы тремя участками комплементарности (CDR – complementarity determining regions) вместо 6 участков неканонических антител – по 3 в каждой тяжелой и легкой цепях. В качестве частичной компенсации примерно 2-кратного уменьшения CDR-структур, в верблюжьих антителах увеличена последовательность CDR1 и значительно увеличена последовательность CDR3. Благодаря особому строению антигенсвязывающих центров однодоменные антитела могут иметь свойства, недоступные для канонических антител, например, способность достигать каталитического центра ферментов, который, как правило, погружен в белковую глобулу и закономерно недоступен для канонических антител.

Наноантитела способны к повторной укладке после тепловой денатурации. [25]. Кроме того, некоторые sdAb проявляют высокую термическую стабильность, например ранее описано sdAb с температурой плавления 85 °С [36]. Обмен CDR, (также называется CDR прививки) является техникой используемой для гуманизации антител мыши , а также для создания более стабильных фрагментов обычных антител. Кроме того, она была применена к sdAb в целях выявления универсального sdAb для улучшения стабильности, а также для гуманизации sdAb верблюда. Каркасные области являются высоко консервативными участками и даже небольшие различия в этих последовательностях могут оказывать влияние на стабильность. Но за термическую стабильность sdAb отвечают CDR. Предполагается, что сайт связывания sdAb распределяется между всеми CDR и очень чувствителен к небольшим изменениям в структуре[4]. Термостабильность не может быть введена в другие антитела, а стабильность не может быть создана без возможного нарушения функция связывания белка. Замена CDR является жизнеспособным способом повысить термическую стабильность антитела. Введение стабилизирующего взаимодействия часто может быть компенсировано одновременной индукцией дестабилизирующих сил. ScFv позволили инженерным Т-клеткам специфически распознавать и убивать опухолевые клетки [17]. Для подтверждения того, изолированные VHH смогли распознать мембраносвязанный HER2 на клетки-мишени, проводили на основе ELISA и проточной цитометрии. Наблюдались сильные сигналы, когда VHHRR4, VHHRR6 и VHHRR8 инкубировали с HER2 + BT-474 клетки. Трастузумаб и VHH, анти-HER2 VHH были классифицированы на две непересекающиеся группы. Различные аффинности связывания у перекрывающихся и неперекрывающихся VHH показали, что они узнают различные эпитопы на HER2. Ориентация одного эпитопа на опухолевый антиген может привести к появлению вариантов клеток эвакуационных опухолей.