1.1.2 Получение рекомбинантных антиген-узнающих фрагментов антител

Один из наиболее популярных подходов к получению рекомбинантных антиген-узнающих фрагментов антител – модифицированный метод фагового дисплея, основанный на отборе из больших библиотек клонированных в фагмидном векторе ДНК-последовательностей (кодирующих рекомбинантные белки, экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов) клонов, кодирующих белки (антитела), способные специфически связывать определенный лиганд (антиген)[25]. Обычно вместо больших целых молекул антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки (scFv), представляющие собой случайные комбинации вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов (кодирующие их последовательности клонируются независимо друг от друга и затем объединяются случайным образом), соединенные короткой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, если правильно сочетаются домены, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных районов и введение линкерного пептида.

Одна из проблем традиционных рекомбинантных технологий – необходимость работы с очень большими по числу клонов библиотеками ДНК рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены все возможные комбинации последовательностей двух случайных вариабельных доменов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов). Помимо этой проблемы, здесь также возникают и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, и проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к агрегации. Упомянутые проблемы в значительной мере преодолеваются при использовании технологии фагового дисплея для клонирования репертуара генов однодоменных антиген-узнающих VHH-доменов (наноантител) неканонических антител HCAb [25]. Практически каждый клон в получаемой библиотеке будет кодировать функциональный VHH-домен, который обладает определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного. В этом случае достаточно использовать относительно небольшие исходные библиотеки (из 10⁶ клонов) для эффективного отбора клонов нужных наноантител. Получаемое “на выходе” наноантитело, в отличие от вариабельных доменов классических антител, как правило, хорошо растворимо, устойчиво к значительным колебаниям температуры и pH, а также может быть экономично наработано в больших количествах в бактериях или дрожжах.

Хотя в качестве источника наноантител можно помимо иммунных библиотек – использовать неиммунные (“наивные”) и синтетические библиотеки, именно в случае иммунных библиотек чаще удается получить высокоаффинные наноантитела [23].

Рисунок 1.2 - Схематическое изображение обнаруживаемых традиционных и однодоменных антител, и их фрагментов

Наиболее эффективная процедура получения наноантител включает следующие три этапа (рисунок 1.2). Во-первых, это индукция образования антител (HCAb) при иммунизации животного (из семейства верблюдовых). Обычно проводят пять повторяющихся подкожных инъекций антигена, смешанного с адъювантом Фрейнда, в течение 2–2.5 мес. (процедура подобна той, что используется при иммунизации кролика или козы). Во-вторых, осуществляют клонирование всего репертуара генов наноантител из В-лимфоцитов периферической крови иммунизированного животного. Обычно для этого достаточно 100 мл крови. Проводят ряд последовательных биохимических и молекулярно-биологических процедур – выделения из фракции белых клеток крови полиаденилированных РНК, синтеза кДНК, двухстадийной ПЦР со специфическими праймерами, рестрикции и очистки библиотеки последовательностей генов наноантител, встраивания этих последовательностей в фагмидный вектор. Наконец, проводится базирующаяся на методе фагового дисплея процедура селекции наноантител с заданной специфичностью. Значительное число исследований посвящено получению наноантител для диагностики и лечения раковых заболеваний.

История любого антитела начинается с поиска адекватной мишени, т.е. антигена. Учитывая наличие сотен антигенов на поверхности клетки, чрезвычайно важно и наиболее сложно найти подходящие. При этом, по общему мнению, идеальная мишень должна соответствовать ряду требований[2]:

• играть важную роль в развитии опухоли (например, обеспечивать трансдукцию пролиферативного сигнала);

• экспрессироваться этот антиген должен преимущественно (желательно только) на опухолевых клетках и отсутствовать или быть слабо экспрессированным на нормальных;

• экспрессироваться антиген должен наиболее часто встречающимися опухолями, в противном случае использование антитела будет ограничено небольшой группой больных.

В настоящее время известны две высокоэффективные мишени: CD20 для ритуксимаба и Her2/neu для трастузумаба [35;28]. Получение нового антитела против новой мишени, к сожалению, не означает, что оно будет клинически эффективным. Доклиническое и клиническое изучение проходят сейчас более 200 антител [45].

Механизм противоопухолевого действия моноклональных антител достаточно сложный и включает следующие элементы [2]:

• комплементзависимая цитотоксичность,

• антителозависимая клеточная цитотоксичность,

• индуцирование апоптоза,

• ингибирование сигнальной трансдукции,

• Аb2 вакцины,

• фагоцитоз (только активированные макрофаги),

• блокада рецепторов (антирецепторы).

Химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела характеризуются фармакокинетическим профилем, аналогичным естественным антителам, по этой причине они имеют более длинную полужизнь, чем, например, мышиные антитела [34].

Проблема использования моноклональных антител при злокачественных опухолях далека от полного разрешения так как:

- биохимическая и биологическая нестабильность моноклональных антител (особенно конъюгированных) требующая их хранения и транспортировки в особых температурных условиях;

- сложности фармакокинетики антител;

- иммуногенность мышиных и крысиных моноклональных антител;

- гетерогенность опухоли и специфичность антител;

- токсичность.