Работа 4. Обнаружение активности пероксидазы

Цель: обнаружить и сравнить активность пероксидазы в различных растительных объектах

Объекты, реактивы, оборудование: листья разного возраста, проростки растений, клубни картофеля, корнеплоды, сухие и наклюнувшиеся семена; 0,3% Н₂О₂, раствор бензидина; пробирки, воронки, пипетки на 2 мл, штативы для пробирок, ступки фарфоровые, лезвия, фильтровальная бумага.

Краткие сведения

Пероксидаза является протеидом, состоящим из белка и простетической группы – железопорфирина. Установлено, что пероксидаза катализирует окисление различных циклических (фенолы, ароматические амины) и гетероциклических соединений кислородом перекиси водорода. Реакция идет согласно уравнению:

Перекись водорода образуется в клетке как побочный продукт каталитической деятельности флавиновых дегидрогеназ в электрон-транспортной цепи дыхания. Таким образом, деятельность пероксидазы по утилизации токсичной для клетки перекиси водорода косвенно связана с основной ЭТЦ дыхания.

Вместе с тем установлено, что пероксидаза способна функционировать как типичная оксидаза, катализируя окисление субстрата кислородом воздуха:

Е пероксидаза

С убстрат → НАД·Н₂ → ФП → ц.х.В → ц.х.С → ЦХО → О₂

Н⁺ пероксидаза

е^-

1/2О₂→ →Н₂О

Так, пероксидаза с одной стороны, может окислять кислородом воздуха НАД·Н₂, с другой ^___ передавать электроны, полученные от него, на различные акцепторы (например, на цитохром С). В обоих случаях пероксидаза является звеном ЭТЦ дыхания.

Пероксидаза обнаружена практически во всех органоидах клетки и в цитоплазме. Ее легко выделить растиранием растительной ткани в воде или ацетатном буфере (рН 5,4). Обнаружение активности пероксидазы основано на ее способности в присутствии Н₂О₂ окислять бесцветные фенольные соединения до окрашенных хинонов.

Ход работы

При определении активности пероксидазы растительную ткань (около 200 мг) растереть в ступке с водой, слить в пробирку и довести водой до 5 мл. Для сравнения активности пероксидазы в различных объектах следует брать равное по сухой массе количество материала. Полученную смесь отфильтровать в сухую пробирку через увлажненный складчатый фильтр. Количество фильтрата должно быть около 2 мл. К этой вытяжке добавить 2 мл 0,3% перекиси водорода и 2 мл 1,5% раствора бензидина. Встряхнуть пробирку и через 30 с определить интенсивность посинения по 4-балльной шкале.

Результаты записать по форме табл.1.

Таблица 1

Вариант опыта	Активность пероксидазы, балл

Сделать вывод об активности пероксидазы в исследуемых объектах.

Задача. Изучить активность пероксидазы в зависимости:

1) от степени прорастания семян (сухие, наклюнувшиеся);

2) от видовой специфики запасающей ткани разных видов растений (мякоть картофеля, яблока, моркови);

3) от типа ткани определенного органа (кожура, глазки, мякоть клубня картофеля);

4) от возраста листа (молодой, зрелый, старый).