Работа 8. Влияние рН среды на активность амилазы

Цель: изучить влияние рН среды на активность амилазы

Объекты, реактивы, оборудование: вытяжка амилазы из проросших семян ячменя, 0,1н растворы НСl и NaОН, 0,2% крахмальный клейстер, разбавленный раствор йода; пробирки, пипетки на 2 и 5 мл с делениями и без делений, водяная баня, штативы и держатели для пробирок.

Краткие сведения

Активность ферментов зависит от рН среды. Эта зависимость выражается кривой с максимумом, положение которого у разных ферментов существенно различается. Так, оптимум активности кислой фосфатазы лежит в пределах рН 3,0–4,0, хлорофиллазы при рН 5,9, лиазы и рибонуклеазы при рН 8,0. При значениях рН ниже или выше оптимума активность фермента падает. Это объясняется тем, что изменение соотношения концентрации ионов Н⁺ и ОН^– (по сравнению с оптимальным) вызывает нарушение структуры белковой части фермента и, что особенно важно, его активного центра. Это приводит к частичной или полной инактивации фермента. Если же ионизирован и субстрат, то действие выражено еще сильнее.

Опыт по выяснению влияния рН на активность фермента заключается в том, что в реакционную среду, состоящую из субстрата и вытяжки фермента, вводится необходимое количество кислоты или щелочи для создания определенного рН. Можно пользоваться вытяжками фермента в буферных средах с разным значением рН. Через установленное время определяют активность фермента по характеру образующихся продуктов гидролиза.

Ход работы

Приготовить вытяжку амилазы из проросших зерен ячменя (аналогично предыдущей работе). Растереть в фарфоровой ступке примерно 5 г семян ячменя с небольшим количеством кварцевого песка. Насыпать в пробирку (на 1,5 см), залить 10 мл теплой воды (35–40⁰С), смешать с 1–2 каплями глицерина, встряхнуть содержимое и настоять 30 мин. По истечении указанного времени вытяжку профильтровать через увлажненный складчатый фильтр в чистую пробирку.

В штатив поставить в два ряда по 4 пробирки.

В 4 пробирки 1-го ряда налить по 4 мл 0,2% крахмального клейстера и создать необходимое значение рН в каждой, добавляя в первую ^__ 1 мл 0,1н НСl (рН 3), во вторую ^__ 0,2 мл 0,1н НСl и 0,8 мл воды (рН 5,0), в третью ^__ 1 мл воды (рН 7,0), в четвертую ^__ 1 мл 0,1н NаОН (рН 9,0). Внести в каждую по 3 мл вытяжки фермента, перемешать и оставить на 15 мин при комнатной температуре. Пока идет расщепление крахмала, в 4 пробирки 2-го ряда налить по 5 мл разбавленного раствора йода. Через 15 мин из каждой пробирки с соответствующем значением рН взять по 1,0 мл реакционной смеси и внести в пробирки с йодом. По характеру продуктов гидролиза при различных значениях рН оценить активность фермента в баллах. Результаты записать по форме табл. 1.

Таблица 1

рН	Продукты гидролиза		Активность фермента, балл
	название	окраска (рисунок)
3
5
7
9

Построить график зависимости активности амилазы от рН и сделать вывод об значении рН, при котором амилаза максимальна активна.