Работа 6. Обнаружение активной амилазы в растительном материале

Цель: обнаружить активную амилазу в различном растительном материале.

Объекты, реактивы, оборудование: сухие и проросшие семена злаков, бобовых, масличных растений, 0,1, 0,5 и 2% крахмальный клейстер, 20% НСl, стандартный разбавленный раствор I₂ в КI, подогретая вода (35-40⁰С), глицерин; пробирки, воронки, пипетки на 1 мл, штативы для пробирок, цилиндры на 10 мл, ступки фарфоровые, пипетки на 5 мл, бумажные фильтры.

Краткие сведения

Запасные вещества растений (крахмал, белки, жиры и другие высокополимерные соединения) обладают относительно низкой химической активностью. При прорастании семян, корневищ, клубней они гидролизуются до простых и более активных веществ. Этот процесс осуществляется с участием специфических ферментов - гидролаз. Гидролитический распад запасного крахмала может протекать при участии четырех видов гидролаз: α-амилазы, β-амилазы, глюкоамилазы и амилопектин-1,6-глюкозидазы. Фосфоролитический распад ассимиляционного крахмала осуществляется ферментом α-глюканфосфорилазой. По мере набухания сухих семян в период прорастания активность гидролитических ферментов возрастает, при этом содержание крахмала снижается, а сахаров возрастает.

Одно из распространенных запасных веществ – крахмал состоит из остатков глюкозы (С₆Н₁₀О₅)_n и представляет собой смесь двух полимеров: амилозы и амилопектина. Амилоза – линейный полимер, амилопектин - полимер с многократно разветвленной цепью. В связи с особенностями строения гидролиз этих соединений под действием амилазы протекает по-разному. Амилоза сразу расщепляется на молекулы дисахара мальтозы, амилопектин - постепенно, через декстрины (ряд промежуточных продуктов со все более укороченной цепью). Дальнейшее расщепление мальтозы до глюкозы осуществляется уже другим ферментом - мальтозой.

Степень гидролиза крахмала определяется по реакции декстринов с йодом. Крахмал при этом дает синий цвет, а продукты его начального расщепления – амилодекстрины – фиолетовый, эритродекстрины – красный, ахродекстрины - оранжевый, продукты же глубокого гидролиза – мальтодекстрины и мальтоза – не дают реакции с йодом и принимают цвет его раствора.

В покоящихся семенах и других запасающих органах (клубни, корнеплоды) активность амилазы незначительна. При их прорастании она во много раз возрастает. Причем высокая активность фермента обнаруживается там, где в качестве запасного вещества откладывается крахмал. В органах, содержащих другие запасные вещества, этот фермент менее активен или вовсе не обнаруживается.

Ход работы

Для обнаружения активности амилазы используют проросшие семена. В качестве контроля берут сухие семена тех же растений. Для лучшей экстракции фермента желательно пользоваться размельченным материалом.

Для приготовления вытяжки фермента в 2 пробирки берут по 3 г размельченных проросших и 2 г непроросших семян, заливают 10 мл теплой воды (35–40^оС) в каждую, добавляют с 1–2 капли глицерина, встряхивают содержимое и настаивают 30 мин. Затем смесь фильтруют в чистые пробирки через складчатый фильтр, смоченный водой.

Пока извлекается фермент, в штатив ставят 2 ряда пробирок по 8 шт. и в первых пробирках каждого ряда готовят реакционную смесь: наливают по 10 мл 0,5% крахмального клейстера и добавляют по 3 мл экстракта амилазы из проросших и непроросших семян, тщательно перемешивают, встряхивают. В остальные семь пробирок наливают по 5 мл раствора йода. Далее по 1,0 мл реакционной смеси переносят пипеткой в первую пробирку с йодом соответствующего ряда. Пипетки оставляют в пробирках с реакционной смесью. Через каждые 2 мин по 1,0 мл реакционной смеси вносят в следующие пробирки с йодом соответствующего ряда (по возможности одновременно). Степень гидролиза крахмала прямо пропорциональна продолжительности действия на него фермента. Однако, в зависимости от активности последнего в проросших и непроросших семенах получаются различные продукты расщепления крахмала, что видно по окраске содержимого одинаковых по счету пробирок в каждом ряду. Если окажется, что активность фермента невелика, то для получения полного набора продуктов расщепления крахмала необходимо увеличить количество вытяжки фермента или время взаимодействия его с крахмалом (до 5 мин). При низкой активности фермента изменение окраски реакционной смеси в пробирке под действием йода может маскироваться синим цветом, вызванным избытком нерасщепленного крахмала. В этом случае вместо 0,5% крахмального клейстера берут 0,2%.

Провести гидролиз и полученные данные записать по форме табл. 1. Если гидролиз за время опыта (например, 12 мин) не прошел до конца, что определяется по окраске декстринов, в последней графе отмечают низкую активность фермента.

Таблица 1

Вариант опыта	Окраска продуктов гидролиза через интервалы времени, мин						Время гидролиза, мин
	0	2	4	6	10	12	начало	конец	полный

Сделать вывод об активности амилазы в исследуемых объектах. Сравнить активность амилазы в сухих и проросших семенах. Перед началом работы желательно ознакомиться с характером окраски различных декстринов в демонстрационном опыте.