5. Физико-химические методы анализа в биоорганической химии

5.1 Хроматографические методы анализа

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ УГЛЕВОДОВ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

Цель работы: ознакомиться с методом тонкослойной хроматографии углеводов.

Принцип метода. При проведении хроматографического разде­ления углеводов методом тонкослойной хроматографии пластинку с тонким слоем пористого носителя (например, пластинку SiluFol), на которую нанесены растворы углеводов, помещают в растворитель, который, продвигаясь за счет капиллярных сил, перемещает углевод. По завершению хроматографии проводят об­работку пластинки, позволяющую выявить пятна углевода, и рас­четным методом определяют массу углевода в исследуемом растворе.

Оборудование и реактивы: пластинки Silufol или SilufoI–UV, исследуемый (раствор меда) и  стандартный (10 мкг в пробе)  раствор  углевода (глюкозы, галактозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы), растворитель — смесь бутанол-ацетон-вода (4:5:1), в случае использования пластинок Silufol нафторезорциновый реактив (свежеприготовленная смесь равных объемов 20 %-го водного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,2 %-го спиртового раствора нафторезорцина). Микропипетки, пульверизатор в случае использования пластинок SilufoI или источник ультрафиолетового света в случае использования пластинок Silufol–UV, хроматографическая камера, линейка, простой карандаш, планиметр, сушильный шкаф.

Ход работы

Ha пластинке на расстоянии2 смот нижнего края (линия старта) аккуратно намечают карандашом три точки нанесения растворов углеводов. C помощью микропипетки в отмеченные места наносят равные объемы исследуемого раствора углевода (5 – 20 мкг в пробе), разбавленного исследуемого раствора углевода и стандартного раствора углевода таким образом, чтобы получить пятна одного диаметра. После высушивания пятен пластинку помещают в хроматографическую камеру, на дне которой находится растворитель — смесь бутанол-ацетон- вода (4 :5:1). Высота слоя растворителя —1 см. Хроматографию проводят до прохождения растворителем10 смот линии старта. После этого хроматограмму высушивают и проявляют. При использовании пластинок Silufol хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором нафторезорцина и сушат в сушильном шкафу 5 – 10 мин при температуре 90 – 100 ºС для проявления пятен углевода. Пятна глюкозы и галактозы имеют сине–фиолетовый цвет, фруктозы — красно–черный, сахарозы и мальтозы — красный, лактозы — красно–фиолетовый, рамнозы — зеленый, ксилозы — светло–серый, манозы — светло–синий,   арабинозы — сине–зеленый.

B случае использования пластинок Silufol–UV пятна углевода выявляют под ультрафиолетовым светом.

Определяют площадь пятен. Массу углевода в пробе исследуемого раствора (мкг) рассчитывают по формуле

,

где М_st – масса углевода в пробе стандартного раствора;

 S_st, S, Sp – площади пятна стандарта; исследуемого раствора и разбавленного исследуемого раствора;

 P – фактор разведения.

Оформление работы

 Привести расчеты по приготовлению реактивов. Провести ТСХ углеводов, идентифицировать их и определить содержание в пробе.