Часть 1. Выделение клеточных ядер методом дифференциального центрифугирования

Целью данного раздела работы является выделение клеточных ядер для дальнейшей экстракции из них ФПФазы.

В основе метода дифференциального центрифугирования лежит разность в скоростях седиментации частиц, имеющих разные размеры и плотность.

Реактивы: CH₃COONa*3H₂O, CH₃COOH, KCl, MgCl₂*6H₂O, CaCl₂, NaCl, HCl, сахароза, трис.

Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, ножницы, капроновый фильтр, марля, весы, микроскоп, центрифужные стаканы.

Ход работы

Перед работой готовят следующие растворы.

1. Буфер А:0,3 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Этот буфер готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8,  который получают следующим образом:

CH3COONa*3H2O –255,8 г, CH3COOH (ледяная) – 7,2мл.

Объем доводят до1 л водой.

2. Буфер В: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 0,25 Мсахарозы, 25 мМKCl, 10 мМMgCl₂:

трис –1,21 г, сахароза –85,5 г, KCl —1,86 г, MgCl2*6H2O –2,03 г, 0,1 н HCl – 80 мл.

Объем доводят до1 лводой.

 

3. Буфер С: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 3 мМCaCl₂:

трис –1,21 г, сахароза –85,5 г, KCl –1,86 г, CaCl2 –0,333 г, 0,1 н HCl – 80 мл.

Объем доводят до1 лводой.

 

4. Раствор Д:0,2 М NaCl:

NaCl –11,7 г

Объем доводят до1 лводой.

  Клеточные ядра выделяют при температуре +4 ^оС.

  Выделение ядер включает следующие этапы.

1. После размораживания (2 –80 г) ткань измельчают ножницами.

2.  К измельченной ткани добавляют буфер В в соотношении 1 к 4. Затем ткань гомогенизируют в блендоре при максимальных оборотах 1 – 2 мин.

3. Гомогенат фильтруют через 2 слоя марли, затем через капроновый фильтр. Фильтрация необходима для отделения неразрушенных частиц и фрагментов фиброзной ткани.

4. Фильтрат центрифугируют при800 gв течение 7 минут. Центрифугат отбрасывают.

5. Осадок промывают буфером В. Для этого осадок ядер суспензируют в буфере и затем центрифугируют при800 gв течение 7 минут.

6.  Осадок промывают буфером С, так же как в предыдущем случае. Этот этап необходим для лизиса эритроцитов.

7. Осадок промывают раствором Д и затем буфером А. Очищенные ядра используют в дальнейшей работе.

 

Часть2. Экстракция фпФазы из клеточных ядер

  Для экстракции ферментов используют разные методы. К таким методам относятся: механическое разрушение ткани, ультразвуковая обработка, замораживание – оттаивание, использование различных соединений, которые способствуют салюбилизации ферментов и др.

  Целью данного раздела работы является определение концентрации Na-ацетатного буфера, которая более всего подходит для экстракции ФПФазы.

Реактивы: 2М Na-ацетатный буфер рН 5,8.

Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, центрифужные стаканы.

Ход работы

 Для экстракции ФПФазы мы будем использовать 0,4, 0,6, 0,8 и1 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Эти буферы готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8.

  Для экстракции ФПФазы к осадку ядер добавляют 4- кратный объем буфера соответствующей концентрации. Осадок ядер тщательно суспензируют и оставляют нахолоду на 20 мин. Далее суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость используют в качестве препарата фермента. В пробах определяют активность фермента (лабораторная работа №12) и содержание белка (лабораторная работа №7). На основание этих данных рассчитывают общую и удельную активность препаратов ФПФазы. Результаты заносят в таблицу.

Концентрация буфера А, М	Содержание белка, мг	Общее содержание белка, мг	Общая активность ФПФазы, ед.акт.	Удельная активность ФПФазы, ед.акт./мг
0,4
0,6
0,8
1,0

 

На основании полученных данных сделайте вывод, какую концентрацию буфера предпочтительнее использовать.

Определение активности ФПФазы

 

Для определения активности ФПФазы используют реакцию гидролиза паранитрофенилфосфата (пНФФ), которая происходит по следующей схеме:

 

Паранитрофенол (пНФ) в отличие от пНФФ в щелочной среде имеет желтый цвет с максимумом поглощения при длине волны 410 нм. На этом свойстве основан принцип количественного определения продукта реакции.

Для определения активности ФПФазы используют следующие растворы.

Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8,3 мМ пНФФ в0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8 (2,5 мг пНФФ растворяют в 1 мл буфера), 0,1 н NaOH, препарат фермента.

Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

Все растворы перед определением активности нужно прогреть при 37 °С в течение 5 – 10 минут. Затем приготавливают пробы по следующей схеме:

 

Проба	Буфер А, мкл	Субстрат, мкл	Препарат фермента, мкл
Опыт	0	50	50
Контроль	50	50	0

 

Ферментативную реакцию проводят при 37 °С в течение 15 минут. После инкубации реакцию останавливают добавлением 3 мл0,1 МNaOH. Опытная проба должна окрашиваться в желтый цвет. Контрольная проба – бесцветная. Желтый цвет в опытной пробе обусловлен присутствием в ней пНФ. После остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора при 410 нм.

Количество полученного продукта определяют по интенсивности окраски пНФ в щелочной среде, используя молярный коэффициент экстинкции, равный 17,9 · 10³ М^-1 см^–1  по формуле:

Е₄₁₀ ·   V

Х = –––––––––––––,

17,9 · 10³

где:       

Х – количество пНФ в пробе (моль);

Е₄₁₀ – оптическая плотность опытной пробы;

V – объем пробы после остановки реакции (л);

17,9 ·10³ М^-1_.см^–1   – молярный коэффициент экстинкции.

Определив количество гидролизированного субстрата, расчитывают скорость ферментативной реакции, которую выражают в нмолях гидролизованного субстрата за 1 мин. Затем в пробе определяют количество фермента в единицах активности. За единицу активности принимают количество фермента, которое гидролизует 1 нмоль субстрата за 1 минуту.