Практическое задание

 

Задание 1.

1. Определите число оптических изомеров для альдопентоз.

2. Изобразите проекции Фишера всех линейных изомеров альдопентоз.

3. Определите отношение изомеров к D– или L–ряду по последнему от карбонильной группы хиральному центру.

4. Найдите среди изображенных изомеров D–рибозу.

Задание 2.                                    

1. Определите число оптических изомеров у альдогексоз.

2. Изобразите проекции Фишера всех линейных изомеров альдогексоз.

3. Определите отношение углеводов к D– или L–ряду.

Найдите среди изображенных изомеров D–глюкозу, D–галактозу, L–глюкозу.

ЛАБОРАТОРНАЯ  работа  №36

 

Гидролиз полисахаридов

 

Реактивы: 1 %–й раствор сахарозы; 1,5 %–й крахмальный клейстер; фильтровальная бумага; 10 %–й раствор серной кислоты; 5 %–й раствор сульфата меди; 10 %–й раствор гидроксида натрия; концентрированная серная кислота.

Оборудование:  пробирки, водяная баня.

Ход работы

Задание  1. Гидролиз сахарозы.

1. В две пробирки поместите по 10 капель раствора сахарозы.

2. В одну пробирку добавьте 1 – 2 капли 10 %–го раствора серной кислоты.

3. Пробирку с подкисленным раствором сахарозы поставьте в почти кипящую водяную баню. Через 20 минут пробирку достаньте и охладите.

4. В обе пробирки прибавьте по 1 капле раствора сульфата меди и по каплям прибавляйте 10 %–й раствор гидроксида натрия до появления интенсивно–синей окраски, свидетельствующий о полной нейтрализации кислоты.

5. Нагрейте обе пробирки на водяной бане. В обеих ли пробирках появилась оранжево–желтая окраска?

Задание  2. Гидролиз крахмала.

1.  Поместите в пробирку 10 капель крахмального клейстера и добавьте 2 капли 10 %–го раствора серной кислоты.

2.  Поставьте пробирку в кипящую водяную баню. Через 30 минут пробирку выньте. Раствор стал прозрачным.

3.  К полученному раствору добавьте 1 каплю раствора сульфата меди и по каплям добавляйте 10 %–й раствор гидроксида натрия до появления интенсивно–синей окраски.

4.  Нагрейте пробирку на водяной бане. Появляется оранжево–желтая окраска.

Задание 3. Гидролиз целлюлозы.

При выполнении этого задания необходимо соблюдать особую осторожность!

1. Поместите в пробирку мелкоизмельченный кусочек фильтровальной бумаги и добавьте 1–3 капли (ОСТОРОЖНО!)концентрированной серной кислоты так, чтобы кислота смочила бумагу.

2. Смесь осторожно нагрейте (обычно достаточно тепла руки) до почти полного растворения целлюлозы.

3. К полученному раствору добавьте 10 капель воды, хорошо перемешайте и поместите пробирку в кипящую водяную баню на 30 минут.

4. По окончании реакции к небольшой порции раствора прибавьте 1 каплю раствора сульфата меди и по каплям добавляйте 10 %–й раствор гидроксида натрия до появления интенсивно–синей окраски.

5. Нагрейте пробирку на водяной бане. Появляется оранжево–желтая окраска.

Оформление результатов

Оформите проведенные исследования в виде таблицы. Сделайте выводы о структуре полисахаридов и продуктах его гидролиза.

№ задания	Исследуемое вещество	Наблюдаемое явление	Вывод

Лабораторная работа № 39

 

ЛАБЫ НА ЛИПИДЫ

Определение содержания β -липопротеинов плазмы крови.

Теоретическое введение. Большинство липидов находится в крови не в свободном состоянии, а в составе белково-липидных комплексов: хиломикроны, α-липопротеиды и β -липопротеиды. Липопротеиды можно разделить различными методами: электрофореза, тонкослойной хроматографии, ультрацентрифугирования в солевых растворах различной плотности. При ультрацентрифугировании выделяются хиломикроны и липопротеиды разной плотности: высокой (ЛВП—α-липопротеиды), низкой (ЛНП—β -липопротеиды) и очень низкой (ЛОНП—пре- β -липопротеиды) и др.

Фракции липопротеидов отличаются по количеству белка, относительной молекулярной массе липопротеидов и процентному содержанию отдельных липидных компонентов. Так, α-липопротеиды, содержащие большое количество белка (50—60%), имеют и более высокую относительную плотность (1,063—1,21), тогда как β -липопротеиды и пре-β -липопротеиды содержат меньше белка и значительное количество липидов — до 95% от всей относительной молекулярной массы и низкую относительную плотность (1,01 —1,063).

Принцип метода. В основу метода положена способность β -липопротеидов (ЛПНП) осаждаться в присутствии хлорида кальция и гепарина; при этом изменяется мутность раствора. По степени помутнения раствора и судят о концентрации β -липопротеидов в сыворотке крови. Считают, что гепарин способен образовывать с β -липопротеидами комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок.

Реактивы, оборудование и исследуемый материал:

1. Хлорид кальция (СаСI₂) 0,27% раствор (готовят из безводного реактива).

2. Гепарин, 1% раствор (готовят ex tempore), 1 мл его должен содержать 1000 ЕД (лучше кристаллический).

3. ФЭК.

4. Микропипетка вместимостью 0,2 мл.

5. Сыворотка крови.

Ход работы. В пробирку вносят 2 мл 0,27% раствора СаС1₂ и 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора (Е₁) против 0,27% раствора СаС1₂ по левому барабану в кюветах на 5 мм, при красном светофильтре (630 нм). Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,04 мл 1 % раствора гепарина, перемешивают и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е₂) в тех же условиях:

Расчет. Вычисляют разность оптической плотности и умножают ее на 1000 — эмпирический коэффициент, так как построение калибровочной кривой сопряжено с рядом трудностей. Ответ выражают в г/л. В норме содержание β -липопротеидов составляет 3—4,5 г/л (300—450 мг %). Содержание β -липопротеидов колеблется в зависимости от возраста и пола.

1. Экстракция липидов из биологического материала.

Теоретическое введение. При экстракции липидов принимают во внимание то, что они способны не только к гидрофобным, взаимодействиям, но и к образованию водородных, электростатических и ковалентных связей (сложноэфирных, амидных, гликозидных). Относительно неполярные растворители (хлороформ, бензол, диэтиловый эфир) разрушают комплексы, образованные гидрофобными взаимодействиями в жировой ткани, комплексы альбумина с жирными кислотами. Полярные растворители (этанол, метанол) разрушают водородные и электростатические связи. Их применяют в смеси со слабополярными растворителями при экстракции липидов из плазматических мембран, митохондрий, эндоплазматического ретикулума. Липиды, находящиеся в комплексах, образованных ковалентными связями, растворителями не экстрагируются. Их можно выделить только после гидролиза комплекса слабыми растворами кислот или щелочей в органическом растворителе.

Наиболее распространенным методом экстракции липидов является метод Фолча. Экстракцию проводят смесью хлороформ—метанол (2:1) из расчета 20 частей, экстрагирующей смеси на одну часть ткани. Метод позволяет выделить 90—95% всех клеточных липидов. Смеси растворителей, содержащие спирт, экстрагируют также нелипидные вещества (сахара, аминокислоты, соли и т. д.). Для удаления нелипидных примесей, экстракт липидов промывают водой или слабыми солевыми растворами. Однако это приводит к частичной потере кислых липидов. Очистку экстракта можно провести также гельфильтрацией на сефадексе.

Липиды легко подвергаются окислению и гидролитической деградации. Чтобы затормозить эти процессы, экстракцию липидов проводят при комнатной температуре, применяя растворители, из которых предварительно удален кислород. Извлеченные липиды не упаривают досуха и не оставляют в упаренном виде на долгое время, а сразу растворяют. Экстракты липидов следует хранить в плотно закрытой посуде при -20°С и ниже в присутствии инертных газов. Можно применять антиоксиданты, например 2,6-ди-трет-бутил-n-крезол, который в концентрации 0,005% эффективно предотвращает окислительное расщепление ненасыщенных липидов.

Внимание! Все органические растворители: хлороформ, метанол, гексан, диэтиловый эфир — в той или иной степени ядовиты, поэтому работать с ними нужно под тягой и ни в коем случае не насасывать в пипетку ртом.

Диэтиловый эфир легко воспламеняется, а пары его в воздухе образуют опасные горючие смеси (летуч, кипит при 36°С), поэтому при работе с ним необходимо соблюдать осторожность!

При работе с липидами необходимо пользоваться стеклянной посудой с пришлифованными стеклянными пробками. Смазкой для шлифов пользоваться нельзя! Можно прикрывать колбы и пробирки алюминиевой фольгой.

2. Фракционирование липидов методом адсорбционной хроматографии.

Теоретическое введение. Наиболее эффективным и широко применяемым методом фракционирования сложных смесей липидов является хроматография. Главную роль при аналитическом фракционировании играет адсорбционная хроматография в тонком слое сорбента. Этот метод также применяется в препаративных целях, когда разделению подвергается небольшое количество липидов (50—300 мг). Если масса липидов превышает 300 мг, используют колоночную хроматографию, хотя по разделяющей способности и времени разделения этот метод часто уступает тонкослойной и газовой хроматографии.

Однократного хроматографирования обычно бывает недостаточно для выделения индивидуальных веществ, в связи с этим полученные фракции подвергают препаративной тонкослойной хроматографии или колоночной хроматографии другого типа. При колоночной хроматографии липидов используют не только принцип адсорбции, но и принцип распределения между двумя несмешивающимися жидкостями, гель-фильтрации, ионного обмена.

В основе адсорбционной хроматографии лежит разделение липидов в соответствии со степенью их полярности. Адсорбентом при тонкослойной хроматографии чаще всего служит силикагель. При колоночной хроматографии широкое применение получили три адсорбента: силикагель, окись алюминия, флоризил (силикат магния).

Прочность взаимодействия липида с адсорбентом определяется главным образом водородными и ионными связями, в меньшей степени — силами Ван-дер-Ваальса.

Хроматография на силикагеле. Силикагель является продуктом полимеризации ортокремниевой кислоты (H₄SiО₄). Он выпускается рядом фирм в виде зерен различной величины. Адсорбционные свойства силикагеля обусловлены присутствием на поверхности зерен гидроксильных групп, которые за счет водородных связей взаимодействуют друг с другом и водой. Гидратированный силикагель мало активен как адсорбент. При нагревании от 50 до 150°С происходит дегидратация, приводящая к значительному увеличению адсорбционной способности силикагеля.

При хроматографии 1—3 г липидов пользуются колонками диаметром 35 мм и длиной 50—70 см. При разделении больших количеств применяют большие колонки, при этом максимальное весовое отношение липид/адсорбент не должно превышать 1:50 (для фосфолипидов 1:100). Отношение высоты колонки к площади ее сечения должно быть равно 5:1, длина колонки не должна быть больше 1 м.

При аналитической хроматографии толщина слоя силикагеля обычно не превышает 0,25 мм. Для препаративных целей используют слои толщиной 0,75—1,0 мм на пластинках размером 20Х20 см. В некоторых случаях для лучшего разделения используют удлиненные пластинки (34X20 см). Для аналитического разделения липидов можно применять готовые пластинки. Они представляют собой тонкий слой силикагеля, закрепленный на алюминиевой фольге с помощью крахмала. Для подготовки пластинок к работе их необходимо активировать. Хроматография на окиси алюминия. При проведении препаративных работ хроматография на окиси алюминия имеет ряд преимуществ по сравнению с хроматографией на силикагеле: требуются меньшие объемы растворителей, скорость тока через колонку выше.

Для хроматографии фосфолипидов используют окись алюминия IV степени активности. Ее получают путем активации коммерческой окиси алюминия при 110°С в течение 12 ч, после чего на каждые 100 г адсорбента добавляют 10 мл воды и встряхивают смесь в закрытом сосуде в течение 2 ч. При выделении больших количеств фосфолипидов используют стеклянные колонки с отношением диаметра к длине, равным 1:2,5, в которые помещают до 1000 г адсорбента. При работе с меньшим количеством адсорбента, до 100 г, применяют колонки с отношением 1:5. Нагрузка колонки не должна превышать 0,5 мг липидного фосфора на 1 г адсорбента.

Однако необходимо отметить, что хроматография многих липидных веществ на окиси алюминия сопровождается значительными потерями в результате гидролиза. Омыляемые липиды

Лабораторная работа № 31

Окисление олеиновой кислоты раствором перманганата калия

В пробирку поместите 2 капли олеиновой кислоты, добавьте 2 капли 5 % раствора карбоната натрия Na₂CO₃и 2 капли 2 % раствора перманганата калия KMnO₄.Встряхните пробирку несколько раз. Отметьте, какие изменения происходят с первоначальной фиолетовой окраской раствора.

Не омыляемые липиды. Стероиды

Лабораторная работа № 63

Доказательство непредельности терпенов

В пробирку поместите 2 капли бромной воды и 1 каплю скипидара, встряхните. Водный слой обесцвечивается.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ЛИПИДОВ

 В ТКАНЯХ

 

Цель работы: ознакомиться с весовым методом определения общего содержания липидов в тканях.

Принцип метода. Липиды экстрагируют из тканей смесью Фолча, экстракт отмывают от нелипидных    примесей    солевым    раствором. Количественное определение суммарных липидов проводят весовым методом.

Реактивы:

1.  Хлороформ.

2.  Метанол.

3.  Смесь хлороформ – метанол в соотношении 2:1 по объему (смесь №1).

4.  NaCl 0,73 % водный раствор (можно заменить 0,88 % KCl, 0,05 % CaCl₂).

5.  Смесь растворителей, содержащая минеральные соли: хлороформ-метанол-водный раствор NaCl (0,58 %) или KCl (0,74 %) или СаС1₂ (0,04 %) в соотношении 3:48:47 (смесь №2).

Оборудование: пробирки, гомогенизатор, центрифуга, сушильный шкаф, аналитические весы.

Ход работы

Измельченную на холоде навеску ткани (200 – 250 мг мозга, 300 – 500 мг других тканей) помещают в гомогенизатор с тефлоновым или стеклянным пестиком, заливают 5 объемами смеси №1 и гомогенизируют в течение 5 мин. Экстракт отделяют от биомассы, сливают в мерный цилиндр. Процедуру повторяют еще 2 – 3 раза. Измельченную ткань вместе с экстрактом количественно переносят в мерный цилиндр (конечное разведение ткани 1:20), перемешивают и через 20 мин  фильтруют через обезжиренный фильтр или центрифугируют при 1000 gв течение 15 – 20 мин K центрифугату добавляют 0,73 %–й водный раствор хлорида натрия в объеме, составляющем 20 % от объема экстракта липидов. Экстракт перемешивают и центрифугируют при 600 g в течение 15 – 20 мин. После центрифугирования система разделяется на две фазы. Верхнюю фазу осторожно декантируют с помощью шприца и пипетки с оттянутым концом, отбрасывают. Поверхность нижней фазы и внутренние стенки центрифужной пробирки ополаскивают 3 мл смеси №2, тщательно следя за тем, чтобы не было перемешивания нижней фазы и промывной смеси. Последнюю отбрасывают и промывание повторяют еще 2 раза. После удаления промывной смеси к нижней фазе, т.е. к хлороформному раствору липидов, прибавляют по каплям метанол до образования однофазной системы, раствор перемешивают.

Количество липидов определяют весовым методом. Для этого круглодонную колбу для роторного испарителя доводят до постоянного веса, помещают в нее экстракт липидов, содержащий не менее 10 – 20 мг липидов, растворитель упаривают на роторном испарителе. Колбу с осадком липидов доводят до постоянного веса в вакуумэксикаторе над KOH. Путем повторного взвешивания определяют вес осадка липидов и рассчитывают содержание липидов в тканях в процентах с учетом взятой навески. Взвешивание проводят на аналитических весах.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение аминного азота формольным титрованием по упрощенному методу Зеренсена-Гаврилова.

Белковые гидролизаты представляют собой смесь аминокислот и простейших пептидов. Сырьем для получения гидролизатов могут служить любые полноценные по аминокислотному составу природные белки. В зависимости от сырья все белковые гидролизаты подразделяются на три группы: гидролизаты из крови и ее составных частей, из казеина, из растительных белков.

Гидролиз белка можно осуществить тремя путями: действием протеолитических ферментов (трипсин, пепсин, папаин), кислот и щелочей. В зависимости от условий гидролиз доводят до полного расщепления белка на аминокислоты или часть его сохраняют на пептиды.

Как известно, расщепление белков в организме до простейших пептидов и аминокислот происходит под действием ферментов пищеварительных соков. Аналогичное расщепление белка возможно и вне организма. Для этого к белковому субстрату (кровь, плазма, сыворотка крови и др.) добавляют ткани поджелудочной железы и слизистую оболочку кишечника, желудочный сок или чистые ферменты – пепсин, трипсин, папаин. Затем смесь помещают в термостат на несколько дней, и белки расщепляются до пептидов и аминокислот. Этот способ расщепления белка называется ферментативным, а полученный при этом раствор - ферментативным гидролизатом. Преимущество ферментативного гидролиза заключается в том, что аминокислоты не разрушаются и не происходит их рацемизация. Недостатками метода является сравнительно медленное течение гидролиза, возможность попадания в гидролизат продуктов расщепления самих протеолитических энзимов и возможность загрязнения препарата бактериями.

Гидролиз может происходить при кипячении белков в растворах кислот – кислотный гидролиз. Кислотный метод гидролиза прост и исключает возможность бактериального загрязнения среды. Его недостатки: в процессе гидролиза может разрушиться одна из аминокислот – триптофан, в более слабой степени окисляются треонин и серин. Кроме того, при кислотном гидролизе белков крови, содержащих углеводы, образуются побочные продукты – гумины. Некоторые из них оказывают неблагоприятный биологический эффект.

Химический гидролиз белка является более жестким процессом, как правило, требующим высоких температур и, сравнительно непродолжительного времени. Он осуществляется с помощью кислот и щелочей. Однако расщепление белка с помощью щелочей мало приемлемо в связи с тем, что при таком виде гидролиза разрушается большая часть диаминокислот, интенсивно разлагаются, взаимопревращаются и рацемизируются другие аминокислоты, например, оксиаминокислоты, цистеин.

При кислотном гидролизе тоже имеет место частичное разрушение некоторых аминокислот, но весьма незначительное, позволяющее в основном иметь представление о составе и характере промежуточных продуктов молекулы белка. В первую очередь, при кислотном расщеплении белка подвергается разрушению триптофан, причем интенсивность разрушения этой аминокислоты связана с наличием примеси углеводов и металлов в гидролизуемом белке. Считают, что триптофан превращается в дикарбоновую аминокислоту, а продукты разрушения триптофана – индоловые ядра, конденсируясь с альдегидами, образуют гуминовые вещества.

При кислотном гидролизе также подвергаются частичному разрушению серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик.

В зависимости от избранной концентрации кислоты и длительности ее воздействия на белок интенсивность гидролиза будет протекать различно.

Помимо пептидов в процессе расщепления белка образуется множество других веществ. В состав белкового материала почти всегда входят углеводы, которые также как и белок подвергаются гидролизу и образуют продукты распада; свободные аминокислоты и продукты их окисления, а также продукты вторичной конденсации аминокислот и сахаридов еще более усложняют состав гидролизата.

Соблюдение определенного температурного режима при гидролизе белка позволяет уменьшить дезаминирование оксиаминокислот, хотя в общем-то распад этих аминокислот невелик.

Разрыв пептидных связей при гидролизе белка не является беспорядочным процессом, а происходит в определенных местах и носит закономерный характер. Пептидные связи, образованные оксиаминокислотами при кислотном гидролизе, менее стойки и раскрываются раньше, чем пептидные связи, образованные другимим аминокислотами.

Выбор метода гидролиза для получения лечебного препарата является существенным моментом.

На первый взгляд расщепление белка с помощью ферментов является более приемлемым, поскольку оно соответствует условиям пищеварения в желудочно-кишечном тракте. При расщеплении белка ферментативным путем нет опасности разрушения аминокислот. Вместе с тем, ферментативный гидролиз таит в себе возможность бактериального загрязнения. Температура, оптимальная для действия ферментов (37-78*C), является наиболее благоприятной и для жизнедеятельности микроорганизмов, особенно если учесть, что в некоторых случаях вместо ферментов пользуются поджелудочной железой и слизистой тонкой кишки, взятыми у животных в момент убоя.

Кроме того, конечный продукт ферментативного гидролиза может быть загрязнен примесями чужеродного белка, каковым является сам фермент.

Расщепление белка с помощью минеральных кислот, с этой точки зрения более приемлемо. Кислая среда в сочетании с высокой температурой полностью устраняет возможность бактериального загрязнения гидролизуемой смеси. Это обстоятельство является особенно существенным в том случае, когда дело идет о массовой заготовке белковых гидролизатов в производственных условиях.

Вместе с тем, кислотный гидролизат может быть получен таким образом, что он будет полноценным по аминокислотному составу. Разрушение некоторых аминокислот (триптофан), имеющее место при полном гидролизе белка, может быть сведено к минимуму, если избрать более мягкие условия гидролиза, вызывающие только частичное расщепление белка.

Белковые гидролизаты применяют при заболеваниях, протекающих с белковой недостаточностью, и при необходимости усиленного белкового питания, например, при заболеваниях желудочно-кишечного тракта с нарушениями всасывания белков, интоксикациях, ожоговой болезни, лучевой болезни и др., а также при невозможности питания через рот (например, после операций на пищеводе, желудке и т. п.) и для улучшения репаративных процессов в послеоперационном периоде.

Принцип метода.

Основан на блокировании формальдегидом при рН=7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Реактивы: 1. Раствор 0,1 NNaOH;

2. Раствор 0,1 NHCl;

3. Формалин (40% раствор формальдегида). Перед каждым определением рН формалина доводят до 7,0.

Ход определения.

В химических стаканчик вносят 2 мл испытуемого раствора, прибавляют 18 мл дистиллированной воды и нейтрализуют в зависимости от рН раствора 0,1 NNaOH или 0,1 NHCl до рН=7,0. Вносят 2 мл раствора формольной смеси и титруют 0,1 NNaOH до рН=9,2.

По количеству миллилитра 0,1 NNaOH, пошедшему на титрование, определяется аминный азот в миллиграмм-процентах.

Расчет = А*1,4*100= Х,

V

Где: А – количество миллилитров 0,1 NNaOH, пошедшим на титрование испытуемого раствора;

V – количество испытуемого раствора, взятого на титрование;

Х – количественное содержание аминного азота в миллиграмм-процентах;

1,4 – эквивалент азота, соответвущий 1 мл 0,1 NNaOH.

ЯИЧНЫЙ АЛЬБУМИН

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Фотометрическое определение массовой доли протеинов вбиологических объектов.

Реактивы и растворы

Раствор A. Готовят путем растворения 2 г Na₂CO₃ в 100 см³ 0,1 М раствора NaOH.

Раствор B. Навеску 10 г винно-красного натрия-калия растворяют в 300 см³ дистиллированной воды, добавляют 5 г CuSO₄*5 H₂O и, после растворения соли, доводят объем водой до 1 дм³.

Раствор С. Смешивают 49 см³ раствора А с 1 см³ раствора В. Раствор хранится не более суток.

Раствор Ф (реактив Фолина). Методика приготовления и хранения раствора реактива Фолина. Его готовят следующим образом: смешивают 100г Na₂WO₄*2 H₂O, 25 г Na₂MoO₄, 700 см³ воды, 50 мл 85 %-ной H₃PO₄ и 100 см3 концентрированной HCl и кипятят с обратным холодильником в течение 10 ч. К смеси добавляют 150 г Li₂SO₄, 50 см³ воды и несколько капель бромной воды. Избыток брома удаляют кипячением и объем раствора доводят до 1 дм³. Реактив Фолина хранят в темной закрытой склянке до 1 года. Перед использованием устанавливают его нормальность путем титрования стандартизованным раствором NaOH, а затем разбавляют его дистиллированной водой до нормальности, равной единице.

Непосредственно перед анализом готовят 12 %-ный раствор CuSО₄*5H₂O, 2,5 %-ный и 1 М растворы NaOH и 0,25 М раствор комплексона ІІІ.

Все указанные выше рабочие растворы применяют при фотометрическом определении белка как в исследуемом растворе, так и в стандартных растворах альбумина бычьего сывороточного.

Последние используются для построения градуировочного графика, представляющего зависимость оптической плотности окрашенного раствора от содержания альбумина.

Ход анализа. Выделяют белок из навески средней пробы кормовых дрожжей. В стакан вместимостью 100 – 150 см³ помещают точную навеску высушенных дрожжей массой 0,3 – 0,4 г, добавляют 50 см³ дистиллированной воды и после двухминутного кипячения осаждают белок путем добавления избытка (10 см³) 12 %-ного раствора сульфата меди и 10 см³ 2,5 %-ного раствора NaOH. Осадок медно-белкового комплекса отделяют фильтрованием через бумажный фильтр (с синей лентой) и промывают двумя порциями по 10 см³ воды. Осадок вместе с фильтром возвращают в исходный стакан, где его растворяют путем добавления 50 см³ 1 M раствора NaOH и 20 см³ 0,25 М раствора комплексона ІІІ. Смесь кипятят на песчаной бане в течение 30 мин и постоянном перемешивании. Раствор, содержащий растворенный белок, осторожно переливают в мерную колбу вместимостью 500 см³, оставляя фильтр в стакане. Стенки стакана и нерастворимый осадок промывают тремя порциями по 5 – 10 см³ горячей дистиллированной воды (декантация). Промывные воды собирают в ту же мерную колбу и после охлаждения ее под струей водопроводной воды доводят раствор до метки дистиллированной водой и перемешивают. Отбирают аликвоту (100 см³) полученного раствора, помещают ее в мерную колбу вместимостью 250 см³. Раствор в колбе доводят водой до метки и перемешивают.

С целью отделения взвешенных частиц около 20 см³ раствора фильтруют в сухой стакан через бумажный фильтр с синей лентой, отбрасывая первую порцию (около 10 см³) фильтрата. Отбирают пипеткой 5 см³ очищенного раствора и помещают его в мерную колбу вместимостью 25 см³. Добавляют туда 15 см³ раствора С и осторожно перемешивают содержимое в течение 10 мин.

Затем добавляют 1,5 см³ раствора Ф (реактива Фолина), доводят содержимое до метки водой и тщательно перемешивают. Полученный окрашенный раствор синего цвета фотометрируют в кювете с толщиной поглощающего свет слоя l = 1 см при λ = 690 нм (красный светофильтр). В качестве “нулевого” используют раствор “холостого” опыта, который одновременно получают по указанной методике, заменив в ней 5 ^см3 анализируемого раствора белка на соответствующее количество воды.

Оптическую плотность измеряют не менее трех раз, принимая за истинный результат измерений среднее арифметическое из двух близких.

По величине оптической плотности раствора, используя градуировочный график, вычисляют массовую долю истинного белка в кормовых дрожжах по формуле

ω_белка = γ 0,025/m(1 – W/100),

где — количество белка, определенное по градуировочному графику, мкг; 0,025 — коэффициент разбавления и соотношения размерностей;

m —навеска дрожжей, г;

W — массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %.

Лабораторная работа №8

 

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

 

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

 

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

 

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза.    Белки разделяют при    напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

 

Рис.2.  Схема прибора для низковольтного электрофореза

 

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями  (7), на которую сверху кладутся   смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

 

Реактивы:

1.  Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на   водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б)   веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в)   трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2.  Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3.   Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а)   уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б)   уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов    с    электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б)  для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая:  FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18x45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3).Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

 

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

 

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме   Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

Лабораторная работа

Опыт 1. Хроматографический анализ смеси аминокислот

методом распределительной хроматографии на бумаге

Теоретическое введение. Довольно точным и доступным явля-

ется метод распределительной хроматографии на бумаге (модификация

адсорбционной хроматографии). При этом методе в качестве адсорбен-

та используют специальную фильтровальную бумагу. Хроматографию

проводят в закрытой камере, чтобы избежать испарения растворителя

(рис.1).

Рис. 1. Закрытая камера для распредели-

тельной хроматографии на бумаге (в разрезе):

1 — камера; 2 — крышка; 3 — лодочка с растворителями, в которую погружены

верхние концы бумажных полос; 4 — предметное стекло, закрепляющее бумаж-

ные полосы; 5 — полосы бумаги—хроматограммы; б — подставка для лодочки с

растворителем; 7 — кювета с растворителями.

Рис. 2. Двухкамерная хроматограмма

гидролизата белка на бумаге

Разделение смеси аминокислот методом распределительной

хроматографии на бумаге используют для определения аминокислот-

ного состава белка, для качественного и количественного определения

аминокислот в биологических жидкостях и тканях. Этот метод позво-

ляет выделить отдельные вещества из небольшого количества слож-

ной смеси (рис, 2).

Радиальная хроматография является одной из разновидностей

метода распределительной хроматографии.

Принцип метода. Отдельные аминокислоты обладают раз-

личной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях,

одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органи-

ческий растворитель, например фенол.

36

Рис. 3. Бумажный диск в чашке Петри.

Диск разделен на четыре части. Фенол движется (темное пятно) от центра к периферии и увлекает за собой аминокислоты, нанесенные в каждой четверти диска.

Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен быть полярным (неподвижная фаза), а другой неполярным — подвижная фаза. Более гидрофобная аминокислота или другое вещество, лучше растворяющееся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная ами-

нокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хро-

матографического разделения оказывается на разном расстоянии от

линии старта.

Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри

(рис. 3). Растворитель перемещается от центра к периферии и захва-

тывает аминокислоты, которые распределяются концентрическими

кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения

нингидриновой реакции

Ход работы. 1. В центре бумажного диска или квадрата из хро-

матографической бумаги, стороны которого на 1 см больше диаметра

чашки Петри, делают вырез около 1 см в диаметре. Простым каран-

дашом диск делят на 4 части по диагоналям, затем помещают его на

ножку, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки высо-

той 2 см, вставленной в вырез диска (см. рис. 3). Диск следует держать

за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хромато-

грамме.

2. Отступив от центра на 1 см, в каждом секторе диска обводят

простым карандашом кружки и обозначают их цифрами 1, 2, 3, 4. На-

носят капилляром небольшое количество (1—2 капли) исследуемых

растворов аминокислот: аланина (1), глутамина (2) и лейцина (3). В

четвертый сектор (4) наносят смесь аминокислот. При нанесении ис-

следуемых аминокислот в каждый кружок следят за тем, чтобы капля

наносимого раствора не заходила за кружок. После нанесения раст-

вора бумагу необходимо просушить на воздухе в течение 10 мин, что-

бы не было влажного пятна.

3. На дно чашки Петри (одного диаметра с крышкой ее) наливают 10 37

мл водонасыщенного раствора фенола так, чтобы ножка диска погру-

жалась в раствор. Чашку Петри накрывают крышкой и проводят хро-

матографическое разделение в течение 40—50 мин при комнатной

температуре. По ножке растворитель поднимается вверх и распреде-

ляется по окружности бумажного диска, увлекая за собой нанесенные

аминокислоты. При этом происходит разделение исследуемой смеси

на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью, соответст-

венно коэффициентам их распределения между водой и фенолом. Ко-

гда фронт растворителя дойдет почти до края бумажного диска,

крышку чашки Петри снимают, на нее кладут бумажный диск, удер-

живая пинцетом его края, и помещают в термостат при температуре

90—100 С на 10 мин с целью устранения растворителя— фенола и

фиксации аминокислот.

4. Дли выявления пятен аминокислот хроматограмму опрыски-

вают 0,2% раствором нингидрина (ацетоновым или спиртовым) ли-

бо сухую хроматограмму быстро, одним движением, смачивают

раствором нингидрина, налитым в чашку Петри, и вновь высушива-

ют в сушильном шкафу при температуре 90—100°С в течение 5 мин.

При этом проявляются аминокислоты в виде отдельных трех полос,

окрашенных в розово-фиолетовый цвет, где каждое пятно соответст-

вует определенной аминокислоте

Сравнивая расположение пятен в исследуемой смеси с положением пятен в

отдельных аминокислотах, устанавливают присутствие в смеси определенных

аминокислот. Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент распределе-

ния — Rf или скорость перемещения по формуле: Rf = a/b, где а — расстояние в

миллиметрах, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до

середины ее пятна; b — расстояние в миллиметрах от места нанесения аминокис-

лоты (линии старта) до фронта растворителя. Чем меньше растворимость амино-

кислоты в воде и чем больше ее растворимость в феноле или в другом органиче-

ском растворителе, тем быстрее она движется вслед за фронтом органического

растворителя, тем больше величина Rf, и, наоборот, чем больше ее растворимость

в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет

передвигаться и тем меньше величина Rf. Коэффициент распределения Rf — ве-

личина постоянная для каждой аминокислоты при постоянных условиях опыта

(температура, сорт бумаги, растворитель). Сравнивают коэффициент распределе-

ния известных стандартных аминокислот с коэффициентом распределения амино-

кислот, полученных для исследуемой смеси и определяют наличие отдельных ами-

нокислот в исследуемом материале.

Опыт 2. Колоночная гель-фильтрация.

Для метода гель-фильтрации используются так называемые мо-

лекулярные сита — инертные гидратированные полисахаридные ма-

териалы, представляющие собой пористые гранулы. Их получают из

бактериальных полисахаридов (сефадексы), агара или полимеризован-

ных акриламидных гелей (акрилекс). 38

П р и н ц и п метода. Молекулы разных размеров различают по

способности проходить через поры внутрь гранул геля. Небольшие

молекулы, эффективно проникающие внутрь гранул сквозь поры,

проходят через колонку, заполненную гелем, медленнее, чем вещест-

ва, молекулы которых слишком велики. Об эффективности разделения

смеси судят по составу вытекающего из колонки раствора (элюат).

При работе с колонкой необходимо соблюдать следующие пра-

вили (рис.4). 1. Над гелем должен находиться слой изотонического рас-

твора хлорида натрия, чтобы гель не высыхал. 2. При отсутствии ка-

пельницы изотонический раствор хлорида натрия добавляют в колонку

аккуратно через воронку из маленького стаканчика, регулируя скорость

элюирования, открыв нижний зажим колонки. 3. При разделении смеси для

гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидко-

сти (т.е. открыт зажим снизу).

Ход работы. Колонку для разделения вещества заполняют гелем,

полученным при гидратировании акрилекса Р-200 изотоническим раство-

ром хлорида натрия. На поверхность геля наносят 2-3 капли фрак-

ционирующего раствора, представляющего собой смесь трех ве-

ществ: насыщенного раствора голубого декстрана (относительная

молекулярная масса порядка 107), рибофлавина (относительная

молекулярная масса около 3 102) и гемоглобина (относительная моле-

кулярная масса 64,5 103). В качестве фракционирующего раствора

можно использовать также смесь (1:1) двух веществ: насыщенного

раствора голубого декстрана и насыщенного раствора бихромата ка-

лия — К2С2О7 (относительная молекулярная масса — 294, 22). Фрак-

ционирующий раствор (смесь 3 или 2 веществ) должен сначала впи-

таться гелем, затем в колонку вносят 2 раза по 2 мл изотонического

раствора хлорида натрия. После этого подключают капельницу с изо-

тоническим раствором хлорида натрия, предназначенным для элюи-

рования (вымывания) разделяемых веществ. По мере прохождения

через колонку элюирующего изотонического раствора хлорида натрия

смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каж-

дую фракцию собирают в отдельную центрифужную пробирку. В со-

ответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюи-

руется декстран (голубой), затем гемоглобин (красный) и рибофлавин

или бихромат калия (желтый).

39

Рис. 4. Схема устройства для гель-фильтрации.

а — до разделения веществ; б — после разделения веществ; в — элюирование

разделенных веществ с колонки. Светлые кружки — гель; черные кружки —

большие молекулы; точки — маленькие молекулы.

1— колонка; 2 — пробка со стеклянной трубкой; 3 — ка-

пельница, содержащая элюирующий раствор; 4 — кран (или

зажим); 5 — кружок фильтровальной бумаги, соответствую-

щий внутреннему диаметру колонки; 6 — поверхность сус-

пензии геля (акрилекс Р-200) определенной пористости; 7 —

изотонический раствор хлорида натрия, слой 2—3 мм (пре-

дохраняет суспензию от высыхания); 8 — смесь фракциони-

руемых веществ

Тема. Нуклеопротеины.

Цель: Сформировать знания химического строения нуклеопротеинов.

Исходный уровень.

Представления из курса биохимии:

1) о строении нуклеопротеинов;

2) о гистонах и протаминах как белковой части нуклеопротеинов;

3) о гетерогенности гистонов;

4) о кислотно-основных свойствах белков.

План занятия:

1. Изучение компьютерной информации.

2. Лабораторная работа.

3. Тестовый контроль (по темам 13-15)

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Гидролиз нуклеопротеинов дрожжей

Для изучения химического состава нуклеопротеинов проводят

кислотный гидролиз дрожжей, поскольку они очень богаты нуклео-

протеинами. Специфическими реакциями для каждого вещества от-

крывают продукты гидролиза — полипептиды, пуриновые основания,

углевод и фосфорную кислоту.

Реакти вы, о б о р уд о в а н и е и и с с л е д уе м ы й материал: 1. Серная

кислота, 10% раствор. 2. Едкий натр, 10% paствор. 3. Сульфат меди, 1% раствор.

4. Аммиак концентрированный, 5. Нитрат серебра, 2% раствор. 6. Молибденовый

реактив. 7. Серна кислота концентрированная. 8. Тимол, 1 % раствор спиртовой 9.

α-Нафтол, 0,2% спиртовой раствор. 10. Лакмус. 11. Дифениламиновый реактив,

1% раствор. 12. Круглодонная колба с воздушным холодильником. 13. Воронка с

фильтром. 14. Мерный цилиндр вместимостью 50 мл. 15. Дрожжи пекарские:

Ход работы. Помещают 2,5 г пекарских дрожжей в круглодон-

ную колбу вместимостью 100 мл с воздушным холодильником для

гидролиза, добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты и колбу за-

крывают пробкой с длинной стеклянной трубкой. Гидролиз дрож-

жей проводят при нагревании в течение часа с момента закипания

жидкости. После охлаждения гидролизат фильтруют и с фильт-

ратом проделывают качественные реакции на составные части нук-

леопротеинов.

Биуретовая реакция на полипептиды. К 5 каплям гидроли-

зата приливают 10 капель 10% раствора едкого натра до отчетливой

щелочной реакции (по лакмусу, опущенному в пробирку), затем 2 ка-

пли 1% раствора сульфата меди; появляется розовая или розово-

фиолетовая окраска.

Серебряная проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидро-

лизата добавляют по каплям крепкий раствор аммиака — приблизи-

тельно 10 капель до щелочной реакции (по лакмусу, опущенному в

пробирку), затем добавляют 10 капель 2% аммиачного раствора нит-

рата серебра. При стоянии через 3—5 мин образуется светло-ко-

ричневый осадок серебряных солей пуриновых оснований (содержи-

мое пробирки перемешивать при стоянии не надо).

Качественная реакция на пентозу (Молиша).

К 10 каплям гидролизата дрожжей добавляют 3 капли 1 % спир-

тового раствора тимола, перемешивают и по стенке пробирки осто-

рожно приливают 20—30 капель концентрированной серной кислоты.

При встряхивании на дне пробирки образуется продукт конденсации

фурфурола с тимолом красного цвета.

При взаимодействии концентрированной серной кислоты с гек-

созами или пентозами происходит дегидратация их: из пентоз образу-

ется фурфурол, а изгексоз оксиметилфурфурол, которые дают с тимолом продукт конденсации →красного цвета:

Качествен-

ная реакция на

углевод. К 5 кап-

лям гидролизата дрожжей приливают 3 капли 0,2% спиртового рас- 58

твора α-нафтола и 20 капель концентрированной серной кислоты; по-

является розово-фиолетовое окрашивание.

Реакция на дезоксирибозу и рибозу. Дифениламин с дезоксири-

бозой дает синее окрашивание, а с раствором рибозы — зеленое. К 5

каплям гидролизата дрожжей добавляют 20капель 1% раствора дифе-

ниламина и кипятят в водяной бане в течение 15 мин; при этом обра-

зуется сине-зеленое окрашивание.

Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 10 каплям

гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива и кипятят.

При этом жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет (не осадок).

Пробирку сразу охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки

появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорномо-

либденовокислого аммония.

Молибденовая проба на фосфорную кислоту: