4.2.3 Инвертаза

(β-фруктофуранозидаза, сахараза)

Инвертаза является карбогидразой, она действует на β-фруктофуранозидазную связь в сахарозе, раффинозе, генцианозе и др. Наиболее активно этот фермент гидролизует сахарозу с образованием редуцирующих сахаров - глюкозы и фруктозы:

инвертаза

С ₁₂Н₂₂О₁₁ + Н₂О С₆Н₁₂О₆ + С₆Н₁₂О₆

сахароза глюкоза фруктоза

Инвертаза широко распространена в природе и встречается почти во всех типах почв. Очень высокая активность инвертазы обнаружена в горно-луговых почвах. Активность инвертазы четко коррелирует с содержанием гумуса и почвенным плодородием. Рекомендуется при изуче­нии влияния удобрений для оценки их эффективности. Методы опреде­ления активности инвертазы почв основаны на количественном учете восстанавливающих сахаров по Бертрану и по изменению оптических свойств раствора сахарозы до и после воздействия фермента. Первый способ может быть применен при изучении фермента с очень широкой амплитудой активности и концентрации субстрата. Поляриметрический и фотоколориметрический способы более требовательны к концентрации сахаров и неприемлемы для почв с высоким содержанием органического вещества, где получаются, окрашенные растворы; поэтому эти методы ограниченно применяются в почвенных исследованиях.

Модифицированный колориметрический метод ф.Х. Хазиева

Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы помещают в колбы емкостью 50 мл, добавляют 5 мл 3-процентного свежеприготовленного раствора сахарозы на фосфатном буфере (рН 4,9) и каплю-две толуола. При биодиагностике почв активность инвертазы определяют без добавления буфера - при рН почвы. Колбы закрывают корковыми пробками, осторожно встряхивают и помещают в термостат при 30 ⁰С на 24 ч. Контролем служат субстраты без почвы и почва, стерилизованная сухим жаром, при 180 ⁰С в течение 3 ч. В течение инкубации колбы периодически встряхивают. После инкубации в колбы добавляют 25 мл дистиллированной воды, взбалтывают и фильтруют. В случае высокой активности инвертазы (особенно в горно-луговых и торфянистых почвах с высоким содержанием гумуса) количество добавляемой воды увеличивают до 50-100 мл. В случае низкой активности количество дистиллята уменьшают до 5-10 мл. Разведение учитывают при расчетах активности фермента.

Берут пипеткой 6 мл фильтрата в пробирку объемом 15-20 мл. Добавляют пипеткой 6 мл реактива Феллинга, перемешивают. Пробирку с ярко-синим раствором нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. При нагревании часть меди реактива Феллинга восстанавливается и выпадает в осадок красного цвета, при этом раствор осветляется. Далее пробирки охлаждают, содержимое центрифугируют 1-3 мин при 1500-3000 об./мин. Колориметрируют при длине волны 630 нм в кюветах шириной 1 см..

Окрашенный раствор лучше колориметрировать на фотоэлектроколоримотре КФК-3 с непрерывной шкалой, так как использование КФК-2 или .подобных ему приборов с ограниченной шкалой дает неточные результаты, ввиду того что большинство значений ложится в левой недробной половине шкалы.

Количество глюкозы (мг/мл) определяют по калибровочной кривой. Полученные данные умножают на 30 (общий объем раствора). Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за 24 ч

Реактивы:

1) свежеприготовленный 3-процентный раствор сахарозы (для хранения раствора в течение нескольких дней добавляют несколько капель толуола);

2) толуол;

3) реактив Феллинга (готовый реактив не хранится и готовится смешиванием двух растворов перед анализом: раствор-1 - 100 г сегнетовой соли (калий-натрий виннокислый) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 75 г КОН или NaOH и доводят объем до 500 мл; раствор-2 - 20 г CuSO₄ растворяют в дистиллированной воде и доводят до 500 мл);

4) стандартный раствор глюкозы. Исходный раствор: 6 мг глюкозы в 1 мл дистиллированной воды. Рабочие растворы готовят, доводя 1, 2, 5, 10, 15, 20 мл исходного раствора (соответственно 0,06, 0,12, 0,30, 0,6, 0,9 и 1,2 мг глюкозы в 1 мл раствора) дистиллятом в мерных колбах до 100 мл. Далее к 6 мл растворов добавляют реактив Феллинга и дальше действуют по описанной выше методике.